食品生物技术导论基因工程

食品生物技术导论基因工程1第1页，课件共140页，创作于2023年2月第一节基因工程概述一、基因及其发展简史二、基因工程涵义三、基因工程的一般步骤第2页，课件共140页，创作于2023年2月1、基因概念基因是DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列。指导人体内重要物质蛋白质等的合成，维持着人体的正常生理功能。如果一个基因不正常，甚至基因中一个非常小的片断不正常，就可以引起发育异常、疾病，甚至死亡。基因是基因工程的操作对象3第3页，课件共140页，创作于2023年2月基因（gene）——生命的最大奥秘物质层面：是染色体上一段脱氧核糖核酸（DNA）序列。功能层面：是遗传信息的载体，编码蛋白质和核糖核酸（RNA）分子功能，调控基因表达。基因1基因2DNA染色体4第4页，课件共140页，创作于2023年2月DNA结构戊糖磷酸单核苷酸碱基脱氧核糖和磷酸基通过3′,5′磷酸二酯键连接形成螺旋链的骨架5第5页，课件共140页，创作于2023年2月3端3端5端5端磷酸二酯键6第6页，课件共140页，创作于2023年2月碱基处于螺旋的内侧第7页，课件共140页，创作于2023年2月1865孟德尔的豌豆实验发现了遗传规律：

同对因子分离异对因子自由组合首次提出了“遗传因子”（即基因）现代遗传学之父，奥地利生物学家格雷戈尔·孟德尔2、基因发展简史8第8页，课件共140页，创作于2023年2月1915年至1928年摩尔根的果蝇实验进一步证实了孟德尔因子和孟德尔定律两大重要发现：基因是在染色体上，遗传的基因链锁和互换定律。即建立了作为摩尔根理论主要基础的基因学说。美国遗传学家摩尔根9第9页，课件共140页，创作于2023年2月1953年最伟大的模型

——DNA双螺旋结构模型提出的DNA右手双螺旋结构，在英国《自然》杂志上发表了论文并1962年获得诺贝尔奖。提出了DNA的复制机制—即半保留复制。美国生物化学家沃森（左一）英国生物物理学家克里克(左二）从分子水平揭示了种瓜得瓜，种豆得豆的遗传机理10第10页，课件共140页，创作于2023年2月DNA半保留复制DNA复制时每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。第11页，课件共140页，创作于2023年2月二、基因工程涵义第12页，课件共140页，创作于2023年2月1、基因工程诞生的基础（1）理论上的三大发现

20世纪40年代确定的遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质（肺炎双球菌转化实验）50年代揭示的DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制。50年代末－60年代：中心法则＆操纵子学说及遗传密码的破译。13第13页，课件共140页，创作于2023年2月14第14页，课件共140页，创作于2023年2月中心法则描述的是遗传信息传递表达路径的原理。15第15页，课件共140页，创作于2023年2月（2）基因工程研究的理论依据基因可以重组互换基因可切割基因可转移遗传密码是通用的多肽与基因之间存在对应关系基因可通过复制把遗传信息传递给下一代16第16页，课件共140页，创作于2023年2月（3）技术上的三大发明

60年代末－70年代：DNA分子的体外切割与连接技术。70年代：基因工程载体的使用。70年代：DNA分子的序列分析、琼脂糖凝胶电泳、杂交技术等。1973年Cohen等体外构建细菌质粒的成功标志着基因工程诞生，这年定为基因工程诞生元年。17第17页，课件共140页，创作于2023年2月2、基因工程概念(Geneengineering)指用酶学方法将异源基因与载体DNA进行体外重组，将形成的重组DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所需的生物品种和产物，也称分子克隆或重组DNA技术。工具酶目的或靶基因(源自供体)受体载体基因工程的基本内容和关键技术最终目的第18页，课件共140页，创作于2023年2月3、基因工程的主要内容从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。19第19页，课件共140页，创作于2023年2月三、基因工程的一般步骤第20页，课件共140页，创作于2023年2月生物材料RNADNAmRNAcDNA文库基因组文库人工合成目的基因克隆载体重组DNA受体细胞克隆子转基因生物1、基因工程基本技术路线21第21页，课件共140页，创作于2023年2月剪切拼接导入表达2、基因操作的基本步骤载体供体目的基因受体工具酶第22页，课件共140页，创作于2023年2月即基因工程是基因的一种操作平台与技术基因工程五大基本操作单元：

切、接、转、增、检

DNA的体外重组转化子的筛选与鉴定某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供可能可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中重组DNA分子的转化与扩增23第23页，课件共140页，创作于2023年2月工具酶目的基因（制备）基因载体基因受体基因工程四大要素24第24页，课件共140页，创作于2023年2月第二节工具酶基因工程技术中对核酸的精雕细刻主要用酶作为工具第25页，课件共140页，创作于2023年2月一、限制性内切酶（Restrictionendonuclease）

1、概念指一类以环形或线形双链DNA为底物，能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。26第26页，课件共140页，创作于2023年2月I型酶：在识别位点很远的地方任意切割DNA链，识别特异性差，且需辅助因子，应用价值不大。II型酶：在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链，专一性强，识别与切割序列一致，且无需辅助因子或只需Mg2+，适合基因工程。

III型酶：在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列，无规律；很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。

2、限制性内切酶种类27第27页，课件共140页，创作于2023年2月1973年由H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统由三部分构成，即菌系编号、菌株名、分离顺序。

（1）用属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）组成的3个字母的略语表示寄主菌的物种名，斜体书写。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。（2）菌株名以非斜体符号加在前三个字母后面。如Ecok,EcoR（3）同一菌株中有不同的限制性内切酶时，按分离顺序用罗马字母表示，正体书写。如EcoRI，EcoRV。3、限制性内切酶命名原则28第28页，课件共140页，创作于2023年2月例如：流感嗜血菌d株

属名种名株名Haemophilusinfluenzae

dHindⅢ29第29页，课件共140页，创作于2023年2月（1）作用机制限制性内切酶以环状或线性的双链DNA为底物，在一定条件下，识别一定的核苷酸序列，在两条链的特定的磷酸二酯键上催化切开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段。4、限制性内切酶作用机制和方式30第30页，课件共140页，创作于2023年2月（2）酶切特点识别双链DNA分子中4—8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的对称回文结构。

EcoRⅠ的切割位点

EcoRⅠ的识别序列5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’切割位置识别结构识别长度第31页，课件共140页，创作于2023年2月识别序列：限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列。（同分子中识别序列短的出现几率大，反之亦然）稀切酶：能够识别长序列及富集GC和AT的识别序列（几率小）的内切酶。同裂酶：识别相同序列的限制酶同尾酶：识别序列不同，但切割得到的DNA片段具有相同的黏性末端。各种类型见P18-1932第32页，课件共140页，创作于2023年2月黏性末端：被限制酶交错切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（5’粘性和3’粘性）

GAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG（3）切割方式5’-P3’-OH3’-OH5’-P5’-P5’-P3’-OH3’-OHEcoRⅠ形成具有互补碱基序列的单链黏性末端5’-GAATTC-3’第33页，课件共140页，创作于2023年2月EcoRⅠ产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’37℃4~7℃5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRⅠ34第34页，课件共140页，创作于2023年2月PstI产生的3‘粘性末端

5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’37℃4~7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI35第35页，课件共140页，创作于2023年2月例如：EcoRV的识别位置是：5’……GAT’|ATC……3’3’……CTA’|TAG……5’

其切割后形成5’……GAT和ATC……3’、3’……CTA和TAG……5’。平整末端：同一位点平齐切割DNA两条链而形成的双链末端。

36第36页，课件共140页，创作于2023年2月反应底物（DNA）内切酶用量（活力决定）反应缓冲液（最适pH7.5）适当的温度（37℃）5、限制性内切核酸酶反应系统第37页，课件共140页，创作于2023年2月反应系统缓冲液Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mM低盐酶：0~50mMNaCl0~150mM中盐酶：100mMDTT/BSA1mM高盐酶：150mMVolume20~100μLT,T37℃，1~1.5h1U核酸内切酶的活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1μg标准DNA所需的酶量。38第38页，课件共140页，创作于2023年2月琼脂糖凝胶电泳：DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动，不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。聚丙烯酰胺凝胶电泳：原理同，均为分子筛效应。使用特点：琼脂糖凝胶在分离度上比聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，而在分离范围上优于聚丙烯酰胺。一般琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。鉴定——凝胶电泳39第39页，课件共140页，创作于2023年2月40第40页，课件共140页，创作于2023年2月第41页，课件共140页，创作于2023年2月第42页，课件共140页，创作于2023年2月观察:凝胶成像系统第43页，课件共140页，创作于2023年2月pBI121双酶切大片段的获得

BigfragmentobtainedfrompBI121afterdoubleenzymedigestion

pMD18-T–curcin双酶切小片段的获得SmallfragmentobtainedfrompMD18-T–curcinafterdoubleenzymedigestion13kb

酶切片段第44页，课件共140页，创作于2023年2月二、DNA连接酶1、概念：能催化DNA分子中相邻的3’-OH和5’-P末端之间形成磷酸二酯键，即可封闭双链DNA上相邻核苷酸之间的单链缺口。45第45页，课件共140页，创作于2023年2月2、主要的两种DNA连接酶

（1）大肠杆菌-DNA连接酶：只能连接黏性末端，需NAD+为辅助因子。（同一种限制酶或两种同尾酶）（2）T4-DNA连接酶：连接黏性末端、平整末端，需ATP为辅助因子。（同一种或两种限制酶）

作用：DNA重组中促使载体与目的DNA连接（即两种来源的DNA）。（最适温度37℃，或4~15℃）46第46页，课件共140页，创作于2023年2月5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’37℃EcoRⅠ5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’P-A-A-T-T-C-X-‥-Y-G-OHOH-G-Y-‥-X-C-T-T-A-A-P大肠杆菌连接酶-X-‥-Y--Y-‥-X-第47页，课件共140页，创作于2023年2月载体供体目的基因受体工具酶第48页，课件共140页，创作于2023年2月（1）DNA片段末端修饰核酸外切酶：切成平整末端末端核苷酸转移酶：修饰成互补黏性末端碱性磷酸酶：将5’-P修饰成5’-OH，防止载体自我环化（2）DNA片段加连杆后连接人工合成连杆或衔接头3、非互补黏性末端、非平整末端的连接第49页，课件共140页，创作于2023年2月三、其他工具酶DNA聚合酶：PCR扩增T4多聚核苷酸激酶：催化ATP上磷酸转移至5’-OH上，作为DNA的5’-末端标记。S1核酸酶：分析DNA-RNA杂合子结构；反向转录酶：以RNA为模板，反向转录形成与已知RNA互补的DNA链（构建cDNA文库）。50第50页，课件共140页，创作于2023年2月第三节目的基因的制备一、生物学方法二、化学合成法三、基因文库法四、PCR扩增法51第51页，课件共140页，创作于2023年2月1、目的基因的定义

目的基因：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状，又称特异基因或靶基因。

2、目的基因的来源

真核生物染色体基因组（人和动物）；原核生物染色体；质粒、病毒、线粒体、叶绿体等。52第52页，课件共140页，创作于2023年2月一、生物学方法工作原理：把染色体DNA用限制内切酶切割，将所有片段链接到某载体上，转入大肠杆菌中增殖。再用适当方法筛选出含目的基因的的重组体菌落，从重组体菌落提取DNA，经酶切后获得目的基因。53第53页，课件共140页，创作于2023年2月ori目的基因EcoRIBamHIPstI对象：原核生物基因组较小，基因容易定位，或已知核苷酸序列的DNA分子。优点：快速简便、产物纯度高。54第54页，课件共140页，创作于2023年2月二、化学合成法如果已知某基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，可以利用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。通常是先合成一定长度（~200bp）、具有特定序列的寡核苷酸片段。然后将寡核苷酸适当连接组装成完整的目的基因55第55页，课件共140页，创作于2023年2月①合成引物②合成DNA寡核苷酸连杆③合成基因片断④DNA片断的连接重组，采用DNA片段的连接酶有E.coliDNA、T4-DNA连接酶步骤：56第56页，课件共140页，创作于2023年2月工作原理：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。包含某种生物基因组全部基因的受体菌群体称为该生物的基因组文库。三、基因文库法57第57页，课件共140页，创作于2023年2月抽提基因组DNA制备DNA片段DNA片段与载体重组转化宿主菌体筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）基因文库构建流程图物理方法(剪切或超声波)或限制性内切酶

λ噬菌体、plasmid、YAC等每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，即基因文库。第58页，课件共140页，创作于2023年2月构建基因library++ligase59第59页，课件共140页，创作于2023年2月Aplasmidlibrary60第60页，课件共140页，创作于2023年2月四、PCR扩增法（聚合酶链式反应）

PolymerasechainreactionPCR技术是基因扩增技术的一次重大革新；1985年美国PE-Cetus公司的Millis等研制，于1993年获诺贝尔化学奖。PCR技术是指模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列合成及扩增的技术。前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。61第61页，课件共140页，创作于2023年2月PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。解旋酶—双链变单链DNA聚合酶—使链延伸引物DNA的天然复制第62页，课件共140页，创作于2023年2月1、PCR原理PCR技术的实质为体内DNA复制的体外模拟。即使双链DNA热变性而分开成为单链DNA，退火后在低温下，两个与模板互补的引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性和热稳定性进行聚合（延伸）反应。每经过一次变性、退火和延伸为一个循环，所扩增的特定DNA序列数量按几何指数增长。63第63页，课件共140页，创作于2023年2月PCR技术原理模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。55˚C在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA94˚C从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链72˚C变性退火延伸64第64页，课件共140页，创作于2023年2月PCR技术原理示意图靶序列变性和引物复性循环1循环2循环3变性和引物复性链延伸Tag聚合酶链延伸第65页，课件共140页，创作于2023年2月PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增66第66页，课件共140页，创作于2023年2月20-35cycles72℃5~7min4℃12h或更长时间72℃2~4min94~-96℃0.5~1min92~96℃4~6min60℃~37℃0.5-1min变性使双链变为单链退火使复性引物与模板DNA结合Tac聚合酶使延伸2、PCR反应过程67第67页，课件共140页，创作于2023年2月①模板DNA的变性：模板DNA加热至94~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；2、PCR反应步骤68第68页，课件共140页，创作于2023年2月③引物的延伸：DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环“变性--退火--延伸”过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。第69页，课件共140页，创作于2023年2月PCR扩增仪70第70页，课件共140页，创作于2023年2月3、PCR反应体系反应缓冲液

18（l）dNTP（原料基质，由四种三磷酸脱氧核苷酸即dATP、dGTP、dTTP、dCTP组成）

2Primer1（引物）0.5Primer2（引物）0.5DNA分子（模板）1Mg2+（酶的辅助因子，10×buffer）2.5Taq酶（DNA聚合酶）0.571第71页，课件共140页，创作于2023年2月4、PCR的特点灵敏度高——PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝。特异性强——引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能减少非特异性扩增。简便、快速、重复性好——一次性加好反应液，2~4小时完成扩增。对标本的纯度要求低——血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA。72第72页，课件共140页，创作于2023年2月第四节基因克隆载体一、质粒二、λ噬菌体三、其他第73页，课件共140页，创作于2023年2月基因载体的概念将外源DNA或目的基因带入适当宿主细胞（hostcell）的工具或运载体。第74页，课件共140页，创作于2023年2月本身是一个复制子，能自我复制；相对分子质量较小，限制性内切酶切点少，宜于接受目的基因；能给宿主细胞（受体）提供可选择标记，有可供辨认的表形特征，便于筛选；只有单一限制性内切酶切点，即经某限制性内切酶切割后，即可把质粒DNA闭环打开接纳外源DNA片段，又不会丢失自己的片段。以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞利于载体制备载体应具备的条件：提高外源基因的装载量第75页，课件共140页，创作于2023年2月一、质粒质粒（plasmid）是寓于宿主细胞中染色体外的遗传因子，是双螺旋闭环的DNA分子。独立于染色体之外进行复制和遗传，又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录，相对分子量1000~10000ku。广泛存在于细菌、放线菌及酵母细胞质中，某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。76第76页，课件共140页，创作于2023年2月染色体和质粒的区别与联系染色体与质粒均与生物遗传有关。二者都带有能转录并能表达为蛋白质的基因，染色体是生物信息的携带者，其带有大量遗传信息，而质粒则是携带一些表达有特殊功能的蛋白质的基因，有些是对生物绝对需要的。染色体与质粒化学本质不同：染色体的化学本质是由蛋白质和DNA组成的，质粒是DNA，只有质粒可以作为运载体，染色体不可以。77第77页，课件共140页，创作于2023年2月质粒载体的一般特征染色体DNA质粒DNA大肠杆菌细胞第78页，课件共140页，创作于2023年2月1、质粒类型

严紧型质粒：处于“严紧控制”之下，即其复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝。这称为“严紧型”质粒。79第79页，课件共140页，创作于2023年2月

松弛型质粒：处于“松弛控制”之下，每个细菌中可以有10～200份拷贝。更重要的是松弛型质粒的拷贝数可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千份，如pBR322。宿主细胞不合成蛋白质时，染色体和严紧型质粒的复制都中止，但松弛型质粒仍继续进行复制。因此在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理（在培养液中加入适量的氯霉素）抑制蛋白质的合成。第80页，课件共140页，创作于2023年2月2、质粒DNA的提取选择性抽提法：在较温和的条件下，用溶菌酶溶菌，形成的细胞碎片因染色体DNA和质粒DNA有相对分子量上的差异，用高速离心方法分离。相对分子量较小的质粒DNA留于上清液，经乙醇沉淀得到质粒DNA粗制品。碱性SDS法：在pH12.0~12.5范围内使染色体中双螺旋开链DNA选择性变性，而闭环双链DNA不变性。经乙酸钠中和后，SDS引起蛋白质-SDS复合物和相对分子质量高的DNA沉淀，再经高速离心将质粒DNA留于上清液中而分离。第81页，课件共140页，创作于2023年2月碱性SDS法提取质粒DNA的步骤收集细胞加入溶液I(50mM葡萄糖,25mMTris-HCl,10mMEDTA,4~5mg/mL溶菌酶）加入溶液II(0.2MNaOH,1%SDS)加入溶液III(3MNaAcpH4.8)离心除去沉淀，得含质粒DNA的上清液苯酚抽提去除蛋白质乙醇沉淀收集质粒DNA在强碱性环境中暴露时间过长，cDNA可发生不可逆变性第82页，课件共140页，创作于2023年2月3、质粒DNA的纯化碱性蔗糖密度梯度离心法：染色体双螺旋开链DNA易变性，而闭环双链质粒DNA不易变性，在蔗糖浓度梯度中质粒DNA沉降速度大于变性DNA而分离纯化。氯化铯-溴化乙锭（Et-Br）密度梯度离心法：染色体双螺旋开链DNA易和染料Et-Br结合而密度降低，质粒DNA由于紧密闭合而不宜结合，密度大，经离心分离。硝酸纤维素膜吸附法：硝酸纤维素膜吸附单链DNA，染色体DNA易变性形成单链，而与质粒DNA分离。83第83页，课件共140页，创作于2023年2月删除非必需区：减小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量（一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细胞）。加入新的遗传标记基因：引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNA序列：即多克隆位点(multiplecloningsites，MCS)。4、质粒的改造构建84第84页，课件共140页，创作于2023年2月常用质粒载体：（1）大肠杆菌质粒载体AmprTetr识别位点pBR322（4363bp）pBR322（含两个抗生素抗性基因）抗氨苄青霉素抗四环素复制起始点第85页，课件共140页，创作于2023年2月pUC18/19β半乳糖苷酶的肽基因—菌落蓝/白选择标记加入第86页，课件共140页，创作于2023年2月lacZ蓝-白斑筛选：具有完整乳糖操纵子的菌体能翻译LacZ’基因编码β半乳糖苷酶，该酶能水解生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ’基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。第87页，课件共140页，创作于2023年2月（2）穿梭质粒载体（shuttlevector）指能在两种不同生物中复制的质粒载体。如有的质粒载体除了含大肠杆菌源质粒的ori外，还含有蓝藻源质粒的ori，是这两种生物的穿梭质粒载体；还有的能在原核生物（如E.coli）、真核细胞（如酵母）中复制。含有不止一个ori、能携带插入序列在不同种类宿主细胞中繁殖的载体称为穿梭载体（shuttlevectors）。

第88页，课件共140页，创作于2023年2月二、λ噬菌体噬菌体（phage）是病毒的一种，没有细胞结构，由核酸和蛋白质构成。因其缺乏代谢的酶体系，不能脱离宿主细胞而自行繁殖，只能在活体细胞中生长并对宿主细胞有严格专一性。可作为基因载体的主要是λ噬菌体。研究始于上世纪50年代，1974年Davis发现λ噬菌体失去20%的DNA仍不失活，认为此缺失部分可装载其他DNA，至今已构建100多种。第89页，课件共140页，创作于2023年2月λ噬菌体的主要类型：插入型载体（insertionvector）：为λ噬菌体基因组中缺失部分非必要基因，只含1个可供外源DNA插入的限制性内切酶位点。如charon6单切点是EcoRI。替换型载体（replacementvector）：在λ噬菌体的可替换片段两端具有两个限制性内切酶位点，酶切后替换片段与带有所有必需基因的左右臂分开，由外源DNA代替。第90页，课件共140页，创作于2023年2月三、其他载体M13

噬菌体：环状单链DNA病毒：SV40、EBV等。91第91页，课件共140页，创作于2023年2月第五节基因重组基因重组：指将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重组子。重组方式：以黏性末端连接法为主直接黏接：简单、效率高加尾黏接：利用末端核苷酸转移酶在DNA末端制造黏性末端。主要工具酶：T4-DNA连接酶（5’-P和3’-OH）92第92页，课件共140页，创作于2023年2月重组率重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25~75%93第93页，课件共140页，创作于2023年2月5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’37℃EcoRⅠ5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’P-A-A-T-T-C-X-‥-Y-G-OHOH-G-Y-‥-X-C-T-T-A-A-P大肠杆菌连接酶-X-‥-Y--Y-‥-X-94第94页，课件共140页，创作于2023年2月第六节基因的转化与表达一、目的DNA的导入二、扩增检筛三、目的基因表达95第95页，课件共140页，创作于2023年2月一、目的基因导入受体细胞1、宿主细胞（受体细胞）（1）概念：指在转化、转导和杂交中接受外源基因DNA导入的细胞，是重组体扩增的场所。96第96页，课件共140页，创作于2023年2月原核生物细胞：如大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、蓝藻、农杆菌等；真核生物细胞：主要是酵母特点：单细胞；非致病菌，安全；（2）宿主细胞类型：97第97页，课件共140页，创作于2023年2月2、感受态感受态：指宿主细胞能吸收外源DNA分子而有效作为转化受体的某些生理状态。取决于受体细胞自身的生理状态及重组DNA分子的构型和分子大小，一般宿主细胞在对数生长期转化能力最强。感受态细胞：能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。第98页，课件共140页，创作于2023年2月3、转化根据选用的载体系统和受体细胞类型而定：用于微生物细胞基因导入的有直接转化法、化合物诱导转化法、接合转化法、电穿孔转化法等；用于植物细胞基因导入的有微弹轰击转化法、激光微束穿孔转化法等。99第99页，课件共140页，创作于2023年2月将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。转化率：每微克重组DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不生长）。电穿孔转化100第100页，课件共140页，创作于2023年2月二、扩增检筛1、扩增将目的基因与载体切割后连接成重组子（重组DNA）后导入细菌细胞中，转化后的转化子（菌落）被置于含有标记抗菌素的丰富培养基上生长，细菌转化繁殖后即完成目的基因的扩增。便于筛选、鉴定101第101页，课件共140页，创作于2023年2月2、筛选方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。102第102页，课件共140页，创作于2023年2月①根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选:

Ampr（抗氨苄青霉素）Tetr（抗四环素）pBR3224363bpori识别位点AmprTetr103第103页，课件共140页，创作于2023年2月104第104页，课件共140页，创作于2023年2月②利用乳糖操纵子lacZ’基因（蓝白斑）筛选：

具有完整乳糖操纵子的菌体能翻译LacZ’基因编码β半乳糖苷酶，该酶能水解X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ’基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。称之为蓝-白斑筛选。105第105页，课件共140页，创作于2023年2月DNA芯片：将许多特定的DNA寡聚核苷酸或DNA片段（探针）固定在芯片的每个预先设置的区域，将待测样本标记后，利用碱基互补配对的原理同芯片进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，可同时检测成千上万个基因。③应用DNA芯片鉴定重组子106第106页，课件共140页，创作于2023年2月

蛋白质凝胶电泳：PAGE免疫检测法：

酶联免疫吸附法（ELISA）;

蛋白质印迹法（Western

Bloting）；免疫沉淀法；固相放射性免疫测定法（RIA）。④根据目的基因翻译产物（蛋白质、酶、多肽）筛选（无标记基因或无法合成探针时）107第107页，课件共140页，创作于2023年2月三、目的基因的表达基因表达：指使特异基因进一步转录、翻译为相应的蛋白质（酶），获得其代谢产物的过程。目的基因在插入载体后，在其编码顺序的5’端有能被受体细胞识别的启动基因顺序及能和核糖体结合的顺序，则该目的基因就可以表达，从而使基因工程得以实现。108第108页，课件共140页，创作于2023年2月1、来自PCR产物（染色体DNA、RNA提取）2、文库筛选（染DNA、RNA）新产品、产物目的基因克隆载体连接重组DNA分子细菌中原核表达在植物中表达(转基因植物)在酵母中表达病毒中表达分离纯化上游技术下游技术酶切酶切转化感受态宿主细胞目的基因被克隆构建其表达载体转化感受态宿主细胞PCR和酶切鉴定SouthernNorthernWestern

鉴定第109页，课件共140页，创作于2023年2月第七节基因工程在食品工业中的应用一、转基因微生物食品二、转基因动物食品三、转基因植物食品第110页，课件共140页，创作于2023年2月转基因食品

（GeneticallyModifiedFood，GMF）转基因食品：是指用转基因生物制造、生产的食品、食品原料及食品添加物等。主要指用作食品的转基因植物类型：增产型；控熟型；高营养型；保健型；加工型；新品种型111第111页，课件共140页，创作于2023年2月一、转基因微生物食品1、定义：指由转基因微生物产生的食品；或利用转基因微生物为原（辅）料上产加工的食品、食品添加剂；或以使用转基因微生物制造的农药、肥料、饲料的动、植物所产生的食品。该转基因微生物称为工程菌。112第112页，课件共140页，创作于2023年2月2、特点除转基因益生菌培养增殖后作为发酵食品成分直接食用外，转基因微生物一般不作为食品主要成分，而是作为食品加工的辅料成分，如酶制剂；以使用转基因微生物产生的农药、肥料、饲料生产的食品为间接的转基因食品。安全性高。113第113页，课件共140页，创作于2023年2月3、转基因微生物食品的应用（1）提高食品产品的品质（2）简化生产工艺，缩短生产周期（3）食品的抗菌和防腐保鲜（4）食品级酶制剂生产菌的改良（5）保健食品功效成分的生产（6）食品微生物的快速检测114第114页，课件共140页，创作于2023年2月（1）提高食品产品的品质面包酵母的改造应用—最早成功应用的工程菌：导入具有优良特性的酶基因使麦芽透性酶及麦芽糖酶含量显著提高，大大改善面包品质。酿酒酵母的改造应用：导入异源α-乙酰乳酸脱羧酶去除α-乙酰乳酸酶，减少或控制影响啤酒风味的双乙酰含量；导入硫酸盐代谢途径中的MET25基因，降低影响啤酒风味的硫化氢含量。··················115第115页，课件共140页，创作于2023年2月（2）简化生产工艺，缩短生产周期啤酒酵母的改造应用：导入大麦芽中的β-葡聚糖酶基因解决啤酒酵母不能分解利用大分子葡聚糖和糊精等物质，改善啤酒发酵液的沉淀性；导入大麦芽中的α-淀粉酶基因使酵母便可直接利用淀粉进行发酵，无需依赖麦芽生产α-淀粉酶的过程，可缩短生产流程，简化工序，推动啤酒生产的技术革新。116第116页，课件共140页，创作于2023年2月（3）食品的抗菌和防腐保鲜乳酸菌遗传特性的改造应用：抗药基因风味物质基因产酶基因耐氧基因产细菌素基因

··············P35-36。117第117页，课件共140页，创作于2023年2月抗药基因目前，利用乳酸菌发酵得到的产品很多，如酸奶、干酪、酸奶油、酸乳酒等，已应用的乳酸菌基本上为野生菌株。有的野生菌株本身就抗多种抗生素，因而在其使用过程中，抗药基因将有可能以结合、转导和转化等形式在微生物菌群之间相互传递而发生扩散。利用基因工程技术可选育无耐药基因的菌株，当然也可去除生产中已应用菌株中含有的耐药质粒，从而保证食品用乳酸菌和活菌制剂中菌株的安全性。118第118页，课件共140页，创作于2023年2月风味物质基因乳酸菌发酵产物中与风味有关的物质主要有乳酸、乙醛、丁二酮、3-羟基-2-丁酮、丙酮和丁酮等。可以通过基因工程选育风味物质含量高的乳酸菌菌株。119第119页，课件共140页，创作于2023年2月产酶基因乳酸菌不仅具有一般微生物所产生的酶系，而且还可以产生一些特殊的酶系，如产生有机酸的酶系、合成多糖的酶系、降低胆固醇的酶系、控制内毒素的酶系、分解脂肪的酶系、合成各种维生素的酶系和分解胆酸的酶系等，从而赋予乳酸菌特殊的生理功能。若通过基因工程克隆这些酶系，然后导入到生产干酪、酸奶等发酵乳制品生产用乳酸菌菌株中，将会促进和加速这些产品的成熟。另外，把胆固醇氧化酶基因转到乳酸杆菌中，可降低乳中胆固醇含量。120第120页，课件共140页，创作于2023年2月耐氧相关基因乳酸菌大多数属于厌氧菌，这给实验和生产带来诸多不便。从遗传学和生化角度看，厌氧菌或兼性厌氧菌几乎没有超氧化物歧化酶基因和过氧化氢酶基因或者说其活性很小。若通过生物工程改变超氧化物歧化酶的调控基因则有可能提高其耐氧活性。当然将外源SOD基因和过氧化氢酶基因转入厌氧菌中，也可以起到提高厌氧菌和兼性厌氧菌对氧的抵抗能力。121第121页，课件共140页，创作于2023年2月产细菌素基因乳酸菌代谢不仅可以产生有机酸等产物，还可以产生多种抑制性物质如细菌素、CO2等，具有作为食品防腐剂的应用潜力，若通过生物工程技术将细菌素的结构基因克隆到生产用菌株中，不仅可以使不产细菌素的菌株获得产产细菌素的能力，而且为人工合成大量的细菌素提供了可能。122第122页，课件共140页，创作于2023年2月（4）食品级酶制剂生产菌的改良利用基因工程技术不但可以成倍地提高酶的活力，而且还可以将生物酶基因克隆到微生物中，构建基因工程菌来生产酶。据统计，已有70％的工业用酶是用转基因微生物生产的。转基因微生物生产酶的优点：产量高、品质均一、稳定性好、价格低等。123第123页，课件共140页，创作于2023年2月凝乳酶的基因改造应用：凝乳酶是第一个应用基因工程技术把小牛胃中的凝乳酶基因转移至细菌或真核微生物生产的一种酶。1990年美国FDA已批准在干酪生产中使用，目前3/4干酪为转基因产品，大大缓解了凝乳酶供应不足的状况。耐热α-淀粉酶：溶菌酶：葡萄糖氧化酶：················第124页，课件共140页，创作于2023年2月（5）保健食品功效成分的生产维生素C：采用基因重组构建菌株高表达的单链蛋白2,5-DKG还原酶，加速催化维生素C的前提2-KLG的生成，缩短维生素C的生产周期。核黄素（VB2）超氧化物歧化酶（SOD）二十二碳六烯酸（DHA）················125第125页，课件共140页，创作于2023年2月（6）食品微生物的快速检测食源性微生物污染的快速检测：李斯特菌沙门氏菌致泻性大肠杆菌其他致病菌······126第126页，课件共140页，创作于2023年2月二、转基因动物食品涉及类型：家畜家禽：牛、猪、羊、兔、鸡等；水生生物：各种食用鱼类昆虫：食用家蚕主要应用：改变家畜生成速度；改善乳产品的营养组分，特别针对婴幼儿通过生物反应器生产人血清蛋白等。127第127页，课件共140页，创作于2023年2月为了提高乳牛的产奶量，可将采用基因工程技术生产的牛生长激素(BST)注射到母牛体内，既可达到提高母牛产奶量的目的，又不影响奶的质量。同样，为了提高猪的瘦肉含量或降低猪脂肪含量，可将采用基因重组技术生产的猪生长激素，注射至猪体内，便可使猪瘦肉型化，有利于改善肉食品质。128第128页，课件共140页，创作于2023年2月三、转基因植物食品定义：由转基因植物产生的食物或利用转基因植物为原料生产的食品或食品添加剂。主要类型：大豆：大豆种子、大豆、大豆粉、大豆油、豆粕玉米：玉米种子、玉米、玉米油、玉米粉油菜：油菜种子、油菜籽、油菜籽油、油菜籽粕棉花种子