食工基因工程的基本技术

食工基因工程的基本技术第1页，课件共91页，创作于2023年2月技术4DNA重组技术技术6

基因文库构建技术5核酸杂交技术第2页，课件共91页，创作于2023年2月技术4DNA重组技术（一）基因工程的酶学基础（二）基因工程的载体系统（三）连接、转化与重组子鉴定第3页，课件共91页，创作于2023年2月（一）基因工程的酶学基础基因工程常用工具酶主要包括如下：1、限制性内切酶3、连接酶2、DNA聚合酶4、其它修饰酶第4页，课件共91页，创作于2023年2月定义：指能识别特定的DNA序列并在一定的条件下可在识别位置或附近对DNA进行切割的酶。1、限制性内切酶(restrictionendonuclase)第5页，课件共91页，创作于2023年2月限制性内切酶的种类ⅠⅡⅢ限制性活性+++甲基化酶活性+-+DNA识别序列+++切割特异性随机专一

切割位点距识别位点10-25bP对ATP依赖性+-+对Mg2+依赖性+++蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种不同的亚基

第6页，课件共91页，创作于2023年2月限制性核酸内切酶的命名命名规则：寄主菌属名的第1个字母＋种名的前两个字母＋菌株或菌型代号（大写）＋空白＋发现序列（罗马数字）例子：

EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)第7页，课件共91页，创作于2023年2月属名种名菌株Haemophilusinfluenzaed

嗜血流感杆菌d株H

in

dHin

dIII同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶。例子注意斜体哦！第8页，课件共91页，创作于2023年2月

Ⅱ型酶的特性：（1）识别序列：4-8碱基的特异序列，通常具有回文结构：如EcoRI：GGCCAATTTTAA第9页，课件共91页，创作于2023年2月B、平头末端(bluntend):

切割点位于识别位点的中间，切断的DNA片断具有平齐的末端（2）、切割方式：A、粘性末端(stickyend):

两条DNA链上的切割点不一致，切断的DNA片断的末端上含有一条多个核苷酸的单链，包括5’端凸出和3’端凸出。产生两种切割方式：第10页，课件共91页，创作于2023年2月1）、产生

5’端凸出粘性（如EcoRI切点）CTTAAGGAATTC5’--3’

3’--5’

CTTAAG

GAATTC

5’--3’

3’--5’

①产生粘性末端第11页，课件共91页，创作于2023年2月2）、产生3‘粘性末末端：如PstI5’--3’

3’--5’

CTGCAG

GACGTC

CTGCAG

GACGTC

5’--3’

3’--5’

第12页，课件共91页，创作于2023年2月②产生平末端：TTTAAAAAATTT

TTT

AAA

AAA

TTTCCCGGGGGGCCC5′3′5′5′CCCGGGGGGCCC3′3′5′3′DraISmaI第13页，课件共91页，创作于2023年2月（3）同裂酶：①完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。如HindⅢ

和HsuI。HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’

识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。第14页，课件共91页，创作于2023年2月XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

识别位点相同，但切点不同。如XmaI和

SmaI。②不完全同裂酶：第15页，课件共91页，创作于2023年2月来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。如BamHI、BglⅡ、XhoⅡ等。（4）同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHI5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’Xho

ⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。第16页，课件共91页，创作于2023年2月限制性内切酶活性单位U

：

限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。

限制性内切酶活性:

在建议使用Buffer、温度下，在20uL反应体系中1小时使1µg入DNA完全酶切所需的酶。第17页，课件共91页，创作于2023年2月星活性（staractivity）:

在非最适合的条件下酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种活性称星活性。限制性内切酶在使用中，使用不当，会出现所谓的星活性。注意了！！第18页，课件共91页，创作于2023年2月DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。1）.DNA的纯度

影响限制性内切酶活性的因素2）.DNA的甲基化程度

dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。第19页，课件共91页，创作于2023年2月3）.温度

不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。是影响限制酶活性的重要因素。4）.缓冲液(Buffer)商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。MgCl2、NaCl/KCl：

提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：

维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；β－巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。第20页，课件共91页，创作于2023年2月用时在冰上操作；取酶用干燥、灭菌、新的枪头酶用量不能超过酶切总体积的10%；多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲液；关心小贴士告诉你使用时注意事项：第21页，课件共91页，创作于2023年2月2、连接酶（Ligase)连接酶种类：DNA连接酶和RNA连接酶DNA连接酶：

T4DNA连接酶和大肠杆菌连接酶DNA连接酶功能：

间断修复

连接作用第22页，课件共91页，创作于2023年2月1）大肠杆菌连接酶只能连接粘性末端。2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。（1）、两种连接酶连接特点。DNA连接酶：第23页，课件共91页，创作于2023年2月（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，

5’端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：

NAD+（2）.连接条件第24页，课件共91页，创作于2023年2月

效率：粘性末端>平端(100倍)；

5，突出>3，突出；

平端：HaeIII>AluI>HinCII>SmaI1）连接所用的目的片段的状态：（3）、影响连接效果的因素：第25页，课件共91页，创作于2023年2月

ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装；单价离子：150-200mMNaCl，提高连接效果；

PEG：5%以下可以提高连接效率连接效果最好在37℃，但形成的互补不稳定;最佳连接温度：12-16℃，较好的连接效果，互补又较稳定;2）连接温度：3）反应液中的成分：第26页，课件共91页，创作于2023年2月目的或作用：4）插入片段与载体的浓度比例

载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为1﹕3左右，甚至1﹕10或更高。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。第27页，课件共91页，创作于2023年2月♦依赖DNA的聚合酶：DNA聚合酶I♦依赖RNA的DNA聚合酶：逆转录酶♦不依赖DNA的聚合酶：末端转移酶2、DNA聚合酶（Polymerase）（1）DNA聚合酶类型：第28页，课件共91页，创作于2023年2月（2）基因工程中常用的DNA聚合酶1）、大肠杆菌DNA聚合酶2）、Klenowfragment

3）、T7DNA聚合酶4）、T4DNA聚合酶

5）、修饰过的T7DNA聚合酶6）、逆转录酶7）、TaqDNA聚合酶第29页，课件共91页，创作于2023年2月基本性质：

5‘→3‘的DNA聚合酶活性；

5‘→3‘的核酸外切酶活性；

3‘→5‘的核酸外切酶活性。1）、大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）第30页，课件共91页，创作于2023年2月Klenow酶的来源：

—大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。Klenow酶的基本性质：

5‘→3‘的DNA聚合酶活性

3‘→5‘的核酸外切酶活性2)、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）第31页，课件共91页，创作于2023年2月3）、T4、T7-DNA聚合酶基本特性：均具有5‘→3‘的DNA聚合酶活性，3‘→5‘的核酸外切酶活性T4聚合酶3‘→5‘的核酸外切酶活性强，而T7聚合酶5‘→3‘的DNA聚合酶活性第32页，课件共91页，创作于2023年2月依赖于RNA的DNA聚合酶,最主要用途，以mRNA为模板合成cDNA3’AAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTTTTT5’mRNA3’cDNA3’AAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTTTT5’mRNAoligo(dT)12-18反转录酶Mg2+dNTP4)、反转录酶第33页，课件共91页，创作于2023年2月5)、TaqDNA聚合酶

特点：

分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性。用途：

主要用于DNA的体外扩增（聚合酶链式反应）第34页，课件共91页，创作于2023年2月（3）DNA聚合酶的用途：DNA片断探针的标记DNA分子的体外合成DNA分子的体外突变DNA分子的序列分析DNA分子的修复聚合酶链式反应（PCR）第35页，课件共91页，创作于2023年2月4、其它修饰酶碱性磷酸酶：功能为去除DNA或RNA5‘－末端的磷酸反应，包括：

♦来自小牛胸腺的碱性磷酸酶（CIP）

♦来自大肠杆菌的碱性磷酸酶（BAP）磷酸激酶：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸，常用于探针标记其它酶：核酸外切酶III、VII、S1核酸酶、RNaseA、DNaseⅠ第36页，课件共91页，创作于2023年2月（二）基因工程的载体系统第37页，课件共91页，创作于2023年2月载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。第38页，课件共91页，创作于2023年2月具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。载体应具备的条件：第39页，课件共91页，创作于2023年2月

基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。

第40页，课件共91页，创作于2023年2月一、质粒质粒的基本特征：（1）质粒的自主复制性质——质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制。

♦严紧型：1-3拷贝

♦松弛型：10-60拷贝

是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。第41页，课件共91页，创作于2023年2月（2）质粒的不相容性●定义：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。●分子机理：两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制同时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。第42页，课件共91页，创作于2023年2月（3）质粒的可转移性，如F、Col、R质粒等（4）携带特殊的遗传标记：

♦物质抗性：如抗生素、重金属离子

♦物质合成：如细菌毒素、有机碱第43页，课件共91页，创作于2023年2月抗生素基因：blaorampr:抗氨苄青霉素catoramlr:抗绿霉素kanorkanr:抗卡那霉素strorstrr:抗链霉素tetortetr:抗四环素第44页，课件共91页，创作于2023年2月第45页，课件共91页，创作于2023年2月二、噬菌体载体——（bacteriumphage）噬菌体-细菌病毒，由核酸和蛋白质外壳组成；噬菌体类型：温和型和烈性两种第46页，课件共91页，创作于2023年2月1、噬菌体载体属温和型噬菌体；具有COS黏性末端；类型分为：替换型和插入型；

替换型载体-可插入12-25KB的片段

插入型载体-可克隆小于10KB的片段第47页，课件共91页，创作于2023年2月2、柯斯质粒(Cosmid）是一种带有黏性末端位点的质粒构建：是一种以噬菌体为基础为克隆大片段而设计并和质粒共同构建的杂合载体，具有噬菌体的COS位点和质粒的复制子，具有噬菌体和质粒的双重特征。第48页，课件共91页，创作于2023年2月第49页，课件共91页，创作于2023年2月柯斯质粒载体的特征：1、具有噬菌体的特点:具有COS位点-体外包装成噬菌体颗粒环化，不形成噬菌斑2、具有质粒载体的特点:在寄主内复制和具抗生素抗性基因。3、克隆能力强：40-50KB第50页，课件共91页，创作于2023年2月三、人工染色体载体类型BAC：bacterialartificialchromosomes

，细菌人工染色体YAC：yeastartificialchromosome，酵母人工染色体TAC：transferartificialchromosome,可转化人工染色体第51页，课件共91页，创作于2023年2月oriS基因和repE基因是载体复制所必需第52页，课件共91页，创作于2023年2月第53页，课件共91页，创作于2023年2月（三）连接、转化与重组子鉴定3、转化子的筛选和鉴定（检）重组DNA技术的操作过程:1、DNA的体外切割与连接2、重组DNA分子的转化和扩增（转、增）第54页，课件共91页，创作于2023年2月1、DNA连接过程:思考题：具有不同的粘性末端的DNA如何连接？第55页，课件共91页，创作于2023年2月思考：DNA连接后接下来再干什么？第56页，课件共91页，创作于2023年2月2、重组DNA分子的转化和扩增（转、增）（1）转化的方法A、Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化（化学法）B、电穿孔转化第57页，课件共91页，创作于2023年2月A、化学法（CaCl2法)：（2）转化的原理与技术转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。第58页，课件共91页，创作于2023年2月

转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。B、电穿孔转化：第59页，课件共91页，创作于2023年2月（3）、转化率定义另一表述：每微克载体DNA转化后，获得的克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子受体细胞不长）。定义：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。第60页，课件共91页，创作于2023年2月影响转化率的主要影响因素:载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；受体细胞的类型及预处理；转化方法：电击法高于化学法。第61页，课件共91页，创作于2023年2月3、转化子的筛选和鉴定

——进行选择的目的：

借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。第62页，课件共91页，创作于2023年2月

从总体上看，重组体分子的选择与鉴定方法基本上可以分为如下几个类型：（3）基于外源基因产物检测法（1）基于载体遗传标记检测法（2）基于克隆DNA序列检测法第63页，课件共91页，创作于2023年2月（1）、基于载体遗传标记检测抗药性筛选法；显色筛选法。营养缺陷型筛选法；根据载体遗传标记特点，可细分为：第64页，课件共91页，创作于2023年2月ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori抗药性筛选法：抗药类型：氨苄青霉素卡那霉素四环素氯霉素链霉素第65页，课件共91页，创作于2023年2月显色筛选法：第66页，课件共91页，创作于2023年2月限制性酶切图谱法；菌落（噬菌斑）原位杂交法；

DNA序列分析法。

PCR扩增法（2）根据克隆DNA序列检测第67页，课件共91页，创作于2023年2月ROPROISalIBamHITcrPvuIPstIPstIEcoRIClaIHindIIIHindIIBalIAprpBR3224363bpori限制性酶切图谱法第68页，课件共91页，创作于2023年2月DNA序列分析法。Sanger双脱氧法第69页，课件共91页，创作于2023年2月（3）基于插入外源基因表达产物检测：免疫化学检测法：聚丙烯酰胺凝胶电泳法。包括抗体测定法（如ELISA法）、免疫沉淀法前提条件：克隆基因在宿主细胞内表达第70页，课件共91页，创作于2023年2月在琼脂培养基中加入目标蛋白的特异性抗体，目的重组子菌落会分泌出目标蛋白，后者与特异性抗体发生免疫沉淀反应，在菌落周围形成白色的圆斑。免疫化学检测－－免疫沉淀鉴定：第71页，课件共91页，创作于2023年2月免疫化学检测－－ELISA法第72页，课件共91页，创作于2023年2月

聚丙烯酰胺凝胶电泳法。第73页，课件共91页，创作于2023年2月技术5核酸杂交技术(Nucleicacidhybridization)第74页，课件共91页，创作于2023年2月

互补的核苷酸序列通过Waltson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子、DNA-RNA分子的过程称为杂交。一、核酸分子杂交的定义第75页，课件共91页，创作于2023年2月二、核酸杂交类型Southern杂交：Northern杂交：Western杂交：菌落原位杂交：主要类型：DNARNA蛋白质DNA探针DNADNA抗体DNA被检测对象其它：原位杂交：FISH、GISH

斑点(dot)杂交和狭槽(slot)杂交。

第76页，课件共91页，创作于2023年2月三、杂交三要素1、探针（DNA、RNA或抗体）包括探针的来源和标记2、被检测的对象（DNA、RNA或蛋白质）包括被检测样品的分离准备3、杂交膜

--硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman541滤纸第77页，课件共91页，创作于2023年2月1、探针§1、探针的分类按核酸分子的不同：可分为DNA探针和RNA探针根据标记物的不同：可分放射性标记探针和非放射性标记探针；§2、探针的标记方法双链DNA探针标记主要方法：

A、切口平移法

B、随机引物合成法第78页，课件共91页，创作于2023年2月DNA聚合酶Ⅰ：合成DNA链作用A、切口平移法AGDNA酶Ⅰ打开缺口作用DNA聚合酶Ⅰ涉及的相关酶：DNA酶Ⅰ：打缺口作用B、随机引物合成法§原理：是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在

Klenow酶的作用下,合成DNA探针。第79页，课件共91页，创作于2023年2月四、Southern杂交

第80页，课件共91页，创作于2023年2月1、Southern杂交操作步骤:(1)用限制性内切酶酶切DNA,经凝胶电泳分离各酶切片段；(2)转膜：将DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；转膜方式：毛细管转移法、真空印迹法、电转移法。

(6)自显影检查目的DNA所在的位置。(3)预杂交：封阻滤膜上非特异性位点；(4)杂交：让探针与同源DNA片段特异性结合；(5)洗脱：去除非特异性结合的探针；第81页，课件共91页，创作于2023年2月2、

Southern杂交影响因子分析1）、目的DNA在总DNA中所占的比例3）、转移到滤膜上的DNA量2）、探针的大小和标记效率4）、探针与靶DNA的同源性第82页，课件共91页，创作于2023年2月

3、Southern杂交的目的与用途§目的：用来检测被研究DNA中（包括经限制性内切酶切割后的DNA片段或PC