食品发酵菌种的选育与保藏

食品发酵菌种的选育与保藏第1页，课件共69页，创作于2023年2月课时安排：4课时教学目标：了解发酵工业中常用的菌种。

掌握菌种选育方法。

掌握划线培养和涂布培养方法。掌握菌种保藏方法。教学重点：菌种选育方法。菌种保藏方法。教学难点：菌种选育方法。授课方式：多媒体教学、讲授法第2页，课件共69页，创作于2023年2月发酵工业常用微生物及要求一、常见微生物

（一）细菌（bacteria）醋杆菌属（Acetobacter）乳杆菌属（Lactobacillus）芽孢杆菌属（Bacillus）短杆菌属（Brevibacterium）棒杆菌属（Corynebacterium）第3页，课件共69页，创作于2023年2月（二）放线菌（actinomyces）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）链霉菌（Streptomyces）小单孢菌属（Micromonospora）第4页，课件共69页，创作于2023年2月

（三）霉菌（mould）

1.曲霉属（Aspergillus）黑曲霉（A.niger）米曲霉（A.oryzae）黄曲霉（A.flavus）

2.青霉属（Penicillum）桔青霉（P.citrinum）产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。第5页，课件共69页，创作于2023年2月3.根霉属（Rhizopus

）米根霉（R.oryzae）华根霉（R.chinensis）4.红曲霉属（Monascus）第6页，课件共69页，创作于2023年2月（四）酵母（yeast）酵母属（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2.假丝酵母属（Candida）产朊假丝酵母（Candidautilis）3.毕赤酵母属（Pichia）第7页，课件共69页，创作于2023年2月（五）其它微生物1.担子菌（basidiomycetes）即菇类（mushroom）2.藻类（alga）第8页，课件共69页，创作于2023年2月几种菌落第9页，课件共69页，创作于2023年2月

（六）噬菌体（phage）

危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。第10页，课件共69页，创作于2023年2月烈性噬菌体

——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。温和噬菌体

——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。第11页，课件共69页，创作于2023年2月吸附注入核酸合成核酸和蛋白质释放装配第12页，课件共69页，创作于2023年2月

二、微生物工业对菌种的要求1.原料廉价，生长迅速，目的产物产量高。2.易控制培养条件，发酵周期较短。3.抗杂菌和噬菌体的能力强。4.不易变异和退化，不产生任何有害物质和毒素。第13页，课件共69页，创作于2023年2月

第二节工业微生物菌种的选育一、自然选育

1.采样

2.增殖培养方法：（1）控制培养基成分（2）控制培养条件（3）抑制不需要的菌类第14页，课件共69页，创作于2023年2月3.纯种分离（1）划线法：简单、快捷。（2）稀释法：菌落单一均匀。第15页，课件共69页，创作于2023年2月生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落1.2自然选育流程图为何进行复筛？生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落移种进一步选育或保藏斜面种子(初筛)高产菌株沙土管菌株斜面种子摇瓶复筛高产纯化株生产试验生产菌种斜面制备单孢子悬浮液分离出单菌落自然选育是一种纯种选育的方法第16页，课件共69页，创作于2023年2月接种针先以火焰灭菌法灭菌

步骤一固体培养基四区划法接种法第17页，课件共69页，创作于2023年2月轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却

步骤二第18页，课件共69页，创作于2023年2月以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。

步骤三第19页，课件共69页，创作于2023年2月更换一个新的无菌营养平板

步骤四第20页，课件共69页，创作于2023年2月将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区。第21页，课件共69页，创作于2023年2月重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤六第22页，课件共69页，创作于2023年2月由第五步骤的第一区中划出第二区，如右上图。步骤七第23页，课件共69页，创作于2023年2月重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区，如右上图。

步骤八第24页，课件共69页，创作于2023年2月重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。完成后的营养平板，如右上图。步骤九第25页，课件共69页，创作于2023年2月

在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。步骤十第26页，课件共69页，创作于2023年2月需要使用的仪器——震荡机

固体培养基的稀释涂抹接种法第27页，课件共69页，创作于2023年2月吸取准备好欲稀释的菌液第28页，课件共69页，创作于2023年2月吸取充分均匀后的菌液

第29页，课件共69页，创作于2023年2月取含有9mL无菌水之试管，将试管口过火灭菌。将菌液置入，此时试管须做记号为第一次稀释。第30页，课件共69页，创作于2023年2月将试管于震荡机上，使菌液混合均匀第31页，课件共69页，创作于2023年2月取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL，加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。

第32页，课件共69页，创作于2023年2月从最后稀释菌液中吸取0.1mL菌液，置入准备好的无菌琼脂内。第33页，课件共69页，创作于2023年2月将三角玻璃棒浸于酒精中

第34页，课件共69页，创作于2023年2月

将三角玻璃棒在火焰上燃烧（须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃烧）

第35页，课件共69页，创作于2023年2月

使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来，将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目，再依照稀释倍数推算出菌液浓度。

第36页，课件共69页，创作于2023年2月第37页，课件共69页，创作于2023年2月4.生产性能的测定一般采用两步法：初筛：以量为主复筛：以质为主第38页，课件共69页，创作于2023年2月

二、诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质。诱变剂物理：紫外线，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍{第39页，课件共69页，创作于2023年2月

诱变育种的主要环节（1）以合适的诱变剂处理细胞悬浮液

——诱变（2）用合适的方法淘汰负效应变异株，选出性能优良的正变异株——筛选第40页，课件共69页，创作于2023年2月第41页，课件共69页，创作于2023年2月2.3.1诱变剂的种类①物理诱变剂射线如紫外线、X-射线、γ-射线，快中子②化学诱变剂碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯等。化学诱变剂，比物理诱变剂电离辐射有效，而且很经济，但大部分诱变剂是致癌剂，危害性大。第42页，课件共69页，创作于2023年2月物理诱变剂

紫外线、X-射线、

γ-射线、

快中子

特点：紫外线方便、有效、使用安全，其他的几种射线有一定的穿透力化学诱变剂

碱基类似物、吖啶类、烷化剂

特点：高效、经济、但应注意使用安全第43页，课件共69页，创作于2023年2月2.3.2诱变处理的基本方法A.诱变剂的选择

不稳定菌株－－－－温和诱变剂稳定菌株－－－－强烈的、广谱的诱变剂低剂量诱变剂有利于高产菌株的稳定性B.诱变剂剂量的选择①剂量的表示方法：常用杀菌率表示诱变剂的剂量。杀菌率=（m―n）/m×100％

m：未被处理菌体长出的菌落数

n：被处理菌体长出的菌落数

第44页，课件共69页，创作于2023年2月②使用剂量：一般剂量↗诱变率↗，但达到一定剂量后剂量↗诱变率↘。一般使用90-99．9％以上细胞死亡的剂量。而近来则倾向于采用杀菌率为70-80％的剂量，特别是经过一再诱变的高产菌株。在生产实践或科研中，要确定某个诱变剂的合适剂量，是通过多次试验后才决定的，而且更换诱变剂或处理不同的菌株，也还要重新进行试验。C.增效（变）剂有一些因素本身并不是诱变剂，但它们与诱变剂配合使用起到协同作用。第45页，课件共69页，创作于2023年2月D、影响诱变效果的因素①外部环境条件对诱变效果的影响，如温度、氧气、PH、水分等②出发菌株的选择对提高诱变效果具有重要作用。③选择合适的诱变因素剂量也是提高诱变效果的重要条件。④出发菌株的生理状态也影响诱变效率。⑤诱变效应的测定，可分为直接法和浓缩法两种。⑥诱变方法⑦优良突变菌株的筛选直接摇瓶筛选法和琼脂柱预筛选法第46页，课件共69页，创作于2023年2月筛选：将分离培养后的各型单菌落接斜面培养，成熟后接入摇瓶，测定其发酵生产能力的过程。初筛：以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛：则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。第47页，课件共69页，创作于2023年2月突变株的筛选（Selection）随机筛选

(Randomselection)摇瓶筛选法

初筛一般是一个菌株只做一个摇瓶，从大量菌株中选出10-20%较好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养3瓶，并要重复3-5次，选出3-5个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株。

复杂、耗时

第48页，课件共69页，创作于2023年2月琼脂块筛选法

简单、快速，但不准确自动化筛选（筛选几千个菌落数/天）第49页，课件共69页，创作于2023年2月3杂交育种

杂交育种：是指将两个基因型不同的菌株经接合，使遗传物质重新组合，从而产生具有新性状的菌株。要求：进行结合的菌株应带有遗传标记。

(一)杂交育种的目的

1、使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物；

2、把不同菌株的优良性状汇集重组体菌株中，提高产量和质量，甚至改变菌种特性，获得新品种；

3、获得的重组体可能对诱变剂的敏感度得以提高和恢复，以便重新使用诱变方法进行选育。（二）杂交育种的程序1、菌种准备：使用两种菌株，原始亲本和直接亲本菌株。第50页，课件共69页，创作于2023年2月a1营养缺陷型突变株的富集培养方法1：抗生素富集法

方法2：过滤法

第51页，课件共69页，创作于2023年2月a2营养缺陷型的检出

方法1.逐个检出法：方法2.影印法：具体操作误差较大。方法3.夹层法：先长出的菌落在底部作出标记，加入CM培养基后长出的菌落为营养缺陷型，可用打孔器取出。

第52页，课件共69页，创作于2023年2月3.3杂交育种使用的培养基完全培养基：一种含有糖类、多种氨基酸、维生素及核酸碱基等比较完全的营养基质。基本培养基：只含有纯的碳源、无机氮和无机盐类，不含有氨基酸、维生素、核苷酸等有机营养物。有限培养基：在基本培养基或蒸馏水中含有10%—20%完全培养基成分。补充培养基：在基本培养基中加入已知成分的氨基酸、维生素、核苷酸等第53页，课件共69页，创作于2023年2月3.4杂交方法

(1)

混合培养法：要求两亲本菌株必须为互补的营养缺陷型。将两菌株接种到完全培养基上培养至孢子长出，然后将孢子在选择培养基上进行筛选，能长出的菌株为重组菌株。

(2)

平板杂交法：将菌株一在完全培养基上培养至产生孢子，用影印法将菌落孢子印至已铺有另一菌株孢子的完全培养基上，等长出孢子后，用基本培养基筛选重组菌株。

第54页，课件共69页，创作于2023年2月

(3)

玻璃纸转移法

要求：需要有两个遗传标记，一个为营养缺陷型，另一个标记为的抗药性。另一亲本要有不同的营养缺陷型并对此药物敏感。分离方法：在选择培养基上筛选异核系菌落。原理：只有不带药物敏感等位基因，营养缺陷互补的异核系才能生长，得到异核系菌丛，然后在完全培养基上培养得到分离子菌落，然后再在选择培养基上得到重组子。第55页，课件共69页，创作于2023年2月生产菌种的改良一、原生质体融合（protoplastfusion）

1.标记菌株的筛选

2.原生质体的制备

3.原生质体的融合与再生聚乙二醇（PEG）－脱水剂助融剂

Ca2+－提高融合频率

4.融合子的选择第56页，课件共69页，创作于2023年2月原生质体的融合过程

第57页，课件共69页，创作于2023年2月1）菌体的预处理革兰氏阳性菌可加入青霉素破坏壁的形成；链霉菌加入甘氨酸培养到对数期，有利于原生质体的形成；革兰氏阴性菌可加入EDTA等。2）脱壁酶的选择细菌、放线菌主要用溶菌酶；酵母菌和霉菌用蜗牛酶和纤维素酶。第58页，课件共69页，创作于2023年2月

3）渗透压稳定剂对于细菌和放线菌一般采用蔗糖、丁二酸等为渗透压稳定剂；酵母菌则采用山梨糖、甘露醇等；对与霉菌则采用KCl和NaCl等。稳定剂采用的浓度为0.3-0.8mol/L及一定浓度的Ca2+、Mg2+的二价阳离子。第59页，课件共69页，创作于2023年2月

3.原生质体形成率的计算4.原生质体的融合

在融合剂PEG和Ca2+作用下发生融合。或脉冲点击进行电融合。第60页，课件共69页，创作于2023年2月5.融合子的再生和检出主要依靠两个亲本的遗传标记。真正的融合体或假融合体，通过传代分离。6.原生质体的诱变原生质体由于失去了细胞壁，对外界的环境更加敏感。

1）原生质体再生容易发生突变

2）单一亲本灭活

3）双亲株或多亲株灭活融合

第61页，课件共69页，创作于2023年2月二、DNA重组技术（DNArecombinationtechnology）目标DNA片断的获得与载体DNA分子的连接重组DNA分子引入宿主细胞从中选出所需重组DNA分子的宿主细胞第62页，课件共69页，创作于2023年2月菌种保藏（一）保藏目的及原理目的原理创造不利于菌种生长的一切条件，

使其代谢处于休眠状态。使菌种不生长不死亡不污染不降低或不丧失其优良性以尽量延长使用时间第63页，课件共69页，创作于2023年2月低温干燥无氧缺营养不利

条件第64页，课件共69页，创作于2023年2月（二）常用保藏法1.斜面低温保藏法

将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽孢菌保存2－4个月移种一次，酵母菌间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。此法优点是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。第65页，课件共69页，创作于2023年2月

将无菌石蜡（最好的矿物油灭菌方法是以烤箱在170℃下加热1-2h，而非以灭菌锅灭菌）加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位