高中生物人教版选择性基因工程的基本操作程序优质

3.2基因工程的基本操作程序DNA合成仪显微注射技术从社会中来

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。

你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？转基因抗虫棉与普通棉花培育转基因抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)3.2基因工程的基本操作程序（四个步骤）目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。前提核心关键保证一、目的基因的筛选与获取1.目的基因：主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2.实例：3.基因结构：与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）与优良品质相关的基因与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）与毒物降解相关的基因与工业用酶相关的基因等原核细胞的基因结构真核细胞的基因结构非编码区非编码区启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点开始转录编码区原核生物基因终止子：终止转录补充知识：基因结构：非编码区组成：编码区上游与编码区下游功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达启动子：RNA聚合酶结合位点转录起始的信号终止子：终止RNA的合成编码区：编码蛋白质的合成加工转录mRNA前体成熟mRNA真核细胞的基因非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345启动子终止子补充知识：基因结构：原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的连续不连续编码区非编码注意1、非编码序列：包括非编码区和内含子2、编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？思考从生物细胞中直接获取人工合成5.目的基因获取方法：4．目的基因的来源：（一）从基因文库中获取；（二）通过DNA合成仪直接合成（三）利用PCR技术扩增；一、目的基因的筛选与获取反转录法据已知的氨基酸序列推测合成DNA通过DNA合成仪合成（一）从基因文库中获取目的基因1.基因文库概念：

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。2.基因文库类型：（未知序列）基因组文库部分基因文库（包含一种生物的所有基因）（cDNA文库）（包含一种生物的一部分基因）提取某种生物的全部DNA一定大小的DNA片段导入受体菌中储存用适当的限制酶切将DNA片段与载体连接基因组文库基因组文库的构建模式图3.成熟mRNA成熟mRNAcDNA文库成熟mRNA部分基因文库构建模式图4.5.基因组文库与cDNA文库的构建过程比较cDNA文库以原核生物为主真核生物人工合成鸟枪法基因组DNA文库cDNA文库6.基因文库的构建过程某生物体内全部DNA

许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库某种生物某个时期的mRNAcDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入部分基因文库（cDNA文库）7.基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以依据：目的基因的有关信息。

如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性8、从基因文库中得到目的基因的方法目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成（二）人工合成目的基因1．反转录法：2.根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成3、人工合成法DNA合成仪1、前提：基因比较小、核苷酸序列已知（序列已知）2、方法：通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：

对提取出来的基因进行核苷酸序列分析

使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。（三）.利用PCR获取和扩增目的基因PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。1、概念：表3-1DNA复制所需的基本条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶（体外用高温代替）打开DNA双链DNA两条母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链与两条母链结合的2种引物使DNA聚合酶能够从引物3′端连接脱氧核苷酸3、方式：2、条件以指数方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）2n4、PCR过程：变性、复性、延伸三步曲变性：90～95℃复性：55～60℃延伸：70～75℃变性复性延伸变性

（90--95℃）复性延伸5555（55--60℃）（70--75℃）5、PCR的一轮扩增1.变性：目的基因DNA受热变性，解链为单链；2.复性：引物与单链互补结合；3.延伸：合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成_________b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链6、利用PCR获取和扩增目的基因过程：ATCGAATCGGTT

UACCTTAGCCAADNA聚合酶母链DNA子链DNA引物3′3′5′5′知识回顾---DNA复制过程高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化2）TaqDNA聚合酶的应用DNA模板，四种脱氧核苷酸，分别与两条模板链相结合的两种引物，Taq酶4)PCR和细胞内复制的不同点PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸1）DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只有当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶才能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸7、关于PCR的几点说明：3)缓冲液需要为PCR反应提供的物质模板DNA利用PCR获取和扩增目的基因过程：50℃引物1引物2DNA引物95℃利用PCR获取和扩增目的基因过程：引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶利用PCR获取和扩增目的基因过程：72℃第1轮结束第2轮开始利用PCR获取和扩增目的基因过程：95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq利用PCR获取和扩增目的基因过程：72℃第2轮结束利用PCR获取和扩增目的基因过程：利用PCR获取和扩增目的基因过程：循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,82430次循环后靶序列扩增的数量8、PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原则原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子从基因文库中寻找聚合酶链式反应（PCR）扩增化学合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知小结：获取目的基因的常用方法有哪些?初始目的基因的来源1.从生物中直接获取2.人工合成注意：要保持基因的完整性二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、目的：2）使目的基因能够表达和发挥作用。2、组成：a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意：②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。思考1：表达载体为什么一定要有启动子？生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。1、启动子：操纵基因结构基因

启动子RNA聚合酶是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。思考3：标记基因有什么作用？思考2：终止子的作用是什么？

终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。基因表达载体的构建过程两个切口获得目的基因质粒DNA分子限制酶处理DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端〘思考〙用DNA连接酶处理后会出现几种产物？(只考虑两两结合)如何避免质粒的自我环化和目的基因反向连接的问题？（一）转化：目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法①特点：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌②转化过程:具有趋化性（酚）基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。2.将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法提纯含目的基因表达载体受精卵显微注射移植到输卵管或子宫受精卵发育新性状动物（2）操作:显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞（1）微生物作受体细胞原因：（2）常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）（3）过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。受体生物植物动物微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞小结：