SN-T 4656.9-2023 进出口纺织品生物安全检验方法 第9部分：肠出血性大肠杆菌O157：H7

9SN/T4656.—20239进出口纺织品生物安全检验方法H第9部分:肠出血性大肠杆菌O157:7H1

范围本文件规定了进出口纺织品中肠出血性大肠杆菌

O157:H7的检验方法。本文件适用于进出口纺织品肠出血性大肠杆菌

O157:H7的检验。2

规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法28SN/T1538. 培养基制备指南 第1部分:实验室培养基制备质量保证通则28SN/T1538. 培养基制备指南 第2部分:培养基性能测试实用指南SN/T4656. 进出口纺织品生物安全检验方法 第8部分:通则13

术语、定义和缩略语13. 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。113..11ie纺织品生物安全

biosafetyoftextlie一般是指纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁,及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。123..12H c Hi i肠出血性大肠杆菌O157:7

Enterohemorrhagi

EscherH c Hi i肠出血性大肠杆菌

O157:H7是肠出血性大肠杆菌的主要致病菌株,是与公共卫生有关的最重要的出血性大肠杆菌的血清类型,是一种可引起人或牲畜肠出血性腹泻等疾病的细菌性病原体。此病原细菌为革兰氏染色阴性、两端钝圆的短杆菌,最适生长温度为37℃,不发酵或迟缓发酵山梨醇,不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)产生荧光。133..13i实时荧光 PCRrealtmePCRi在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光化学物质的积累实时监测PCR扩增产物总量的方法。143..14lCt值 Cycethresholdl每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。14. 无菌规格板:0cm

。94. 无菌规格板:0cm

。923. 缩略语2下列缩略语适用于本文件。4 f 4MUG(-Methylumbeliery-βD-Glucuronide):-4 f 4p i id i li ip i id i li iiDNA

(eoxyrbonucecacd):脱氧核糖核酸。Taq(Thermusaquatcus):水生栖热菌。i l

i idNTP(eoxyrbonuci l

i i4

材料和设备14. 无菌剪刀、镊子。1234. 电子天平:感量0.1g。234. 无菌均质袋。4 44. 拍击式均质器:004 4264. 无菌干燥棉拭子。67 58 394. 微量移液器:量程0.

μL~20μL,量程100μL~1000μL,量程17 58 394.

恒温培养箱:6℃±1℃。4. 接种环。 31114.0

长波紫外光灯:65nm,功率≤6 31114.1

全自动微生物生化鉴定系统。4.2

载玻片。 :

5114.3

灭菌离心管

:

5114.4

PCR反应管。 2114.5

高速冷冻离心机:000r/min~13000 2114.6

荧光PCR仪。5

培养基和试剂除有特殊说明,所有实验用试剂均为分析纯;分子检测实验用水符合

GB/T6682中一级水的要求。1 22 C 33 44 55 66 771 22 C 33 44 55 66 77 88 95.

改良山梨醇麦康凯(T-SMAC)琼脂:符合附录

A中

A.。5.营养琼脂:符合附录

A中

A.。5.

吲哚培养基:符合附录

A中

A.。5. 柯凡克试剂:符合附录

A中

A.。5. MR-VP培养基:符合附录

A中

A.。5. 甲基红试剂:符合附录

A中

A.。5. V-P甲、乙液:符合附录

A中

A.。9 15. 西蒙氏柠檬酸盐培养基:符合附录

A中

9 1 L 11 1115.0

月桂基硫酸盐胰蛋白胨-MUG(ST-MUG):符合附录

A L 11 1115.1

山梨醇发酵管:符合附录

A中

A.2。5.2

生化鉴定试剂盒。25个采样点,用无菌规格板

4.5)比照按每个采样点20cm5个采样点,用无菌规格板

4.5)比照按每个采样点20cm

面积范围均匀涂抹,每个采样点用1个无菌9115.3

肠出血性大肠杆菌

O157和

H7诊断血清。115.4

灭菌双蒸水。 / /2 i- i 0p15.5

DNA提取液:0mmol

LTrsHCl,2mmol / /2 i- i 0p1用商业化的DNA提取试剂盒。 / //2 i- 4

2 1p1 / /111 515.6

10×PCR缓冲液:00 / //2 i- 4

2 1p1 / /111 515.7

dNTP混合液(0mmol

L):每种核苷酸浓度10mmolL。5.8

引物和探针:引物和探针序列符合附录B。5.9

TaqDNA聚合酶(U/μL)。 C25.0

标准菌株:大肠杆菌标准菌株(ICC10389或等效标准菌株),肠出血性大肠杆菌

O157:H7 C2C菌株(ICC21530或等效标准菌株)。C6

样品制备1116. 样品制备方法1116.. 称量法( (( (12无菌方法打开送检样品,用无菌剪刀

4.1)均匀剪样,在电子天平

4.2)上准确称取剪下的( (( (1225g,剪碎后加入到盛有225mL

mTSB(5.1)的无菌均质袋

4.3)中,用拍击式均质器

4.4)拍打1min~2min,充分混匀。6.. 多点采样洗脱法(2((无菌方法打开送检样品,在样品四周和中间均匀布控5个采样点,用无菌规格板

4.5)比照每个采(2((样点按4cm×5cm(0cm2)面积范围剪裁,每20cm2

采样面积为1份检样,每件样品共采集5份检样,采样面积为100cm2。将上述采集好的5份检样放入盛有200mLmTSB(5.1)的无菌均质袋

4.3)中,用拍击式均质器

4.4)拍打1min~2min,充分混匀,得到一个样品洗脱液。136.. 棉拭子涂抹法13(无菌方法打开送检样品,用

mTSB(5.1)湿润无菌干燥棉拭子

4.6),在样品四周和中间均匀布控(2(2 ((干燥棉拭子

4.6),在4cm×5cm(0cm2)面积范围均匀涂抹,立即用无菌剪刀

4.1)剪去棉拭子(2 ((触部分,将涂抹部分一起放入盛有50mLmTSB(5.1)的无菌均质袋

4.3)中混匀。26.样品制备方法选择原则2216.. 样品制备一般依6.1.

方法为基准方法;2122 2 26.. 当样品为面积较大或较厚实或多孔时,样品制备应采用6.1.

方法。22 2 2检样品面积过大或过小,采样点可按比例增加或减少。23 36.. 当样品质地致密不容易剪碎制备;或样品较贵重,客户要求无损检测的,23 3方法。24 26.. 采用6.1.1、6.1.

方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀液转种时24 2可适当增加直至足够吸出转种。39SN/T4656.—20239H17

方法一 肠出血性大肠杆菌O157:7传统检验方法H17. 原理利用肠出血性大肠杆菌

O157:H7不能发酵或迟缓发酵山梨醇的特性,接种含山梨醇的CT-SMAC琼脂平板进行初筛分离;利用肠出血性大肠杆菌

O157:H7不能分解4-甲基伞形酮-βD-葡萄糖醛酸苷(MUG)产生荧光(MUG试验阴性)的特性,结合血清学实验,准确判定肠出血性大肠杆菌

O157:H7。27. 检验程序2检验程序见图1。H图1

肠出血性大肠杆菌O157:7传统检验方法程序H3317. 操作步骤3317.. 增菌1 (将按6.

制备好的样品匀液放入36℃±1℃恒温培养箱

4.8)中,增菌培养241 (327.. 分离32( 1 ((用无菌接种环

4.9)挑取7.3.

增菌液接种于两个CT-SMAC

5.2)平板。放置36℃±1℃( 1 ((培养箱

4.8)培养24h±2h。培养结束后观察各个平板上菌落生长情况,如无可疑或典型菌落生长,可直接报告样品中肠出血性大肠杆菌

O157:H7未检出;如有可疑或典型菌落长出,则挑取可疑或典型菌落纯化后进行生化试验和血清学试验确认。CT-SMAC平板上肠出血性大肠杆菌

O157:H7典型菌落特征淡褐色中心、扁平透明、边缘光滑。337.. 纯化菌落33(分别挑取CT-SMAC选择性平板上5个以上可疑或典型菌落,接种营养琼脂

5.3)平板,于36℃±(1℃培养24h±2h纯化,挑取纯化后的菌落同时做如下确证实验。49SN/T4656.—20239347.. 生化试验343417... 吲哚试验341(( 1342挑取7.3.

纯化后的单个菌落接种吲哚培养基

5.4),置36℃±1℃培养24h±2(( 1342试剂

5.5)0.

mL,阳性反应出现红色环,阴性为黄棕色环。肠出血性大肠杆菌

O157:H7能分解色氨酸产生吲哚,试验阳性。7... MR-VP试验( 3( 2 (挑取7.3.

纯化后的菌落分别接种两管

MR-VP培养基

5.6),6℃±1℃培养( 3( 2 (滴加甲基红试剂

5.7)

滴~3滴,立即观察结果;一管按6∶2的比例依次滴加

V-P甲、乙液

5.8)后30min内观察结果。变红色为阳性,不变色为阴性。肠出血性大肠杆菌

O157:H7能分解葡萄糖,加入甲基红指示剂立即显红色,即

MR试验阳性,滴加

V-P甲、乙液后颜色不变,即

VP试验阴性。3437... 柠檬酸盐试验343(挑取7.3.

纯化后的单个菌落接种西蒙氏柠檬酸盐培养基

5.9)后36℃±1℃培养48h±2h,观(察其颜色变化情况。肠出血性大肠杆菌

O157:H7不能利用柠檬酸盐为碳源,柠檬酸盐试验阴性。培养基颜色不变。3447... MUG试验344(CC ((挑取7.3.3

纯化后的单个菌落接种

LST-MUG

肉汤管

5.9),同时取大肠埃希氏标准菌(CC (((ICC10389或等效标准菌株)(5.20)菌液接种

LST-MUG

肉汤管做阳性对照,取肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株(ICC21530或等效标准菌株)(5.20)菌液接种

LST-MUG

肉汤管

5.9)做阴性对照。于36℃±1℃培养24h±2h。培养结束后将LST-MUG肉汤管置长波紫外灯

4.10)下观察,大肠埃希氏菌株

MUG阳性,有荧光产生;肠出血性大肠杆菌

O157:H7MUG阴性,无荧光产生。3457... 山梨醇发酵试验345(挑取7.3.

纯化后的单个菌落接种山梨醇发酵管

5.11),置36℃±1℃培养24h±2h后观察是(否发酵。肠出血性大肠杆菌

O157:H7不能发酵或迟缓发酵山梨醇,发酵管蓝绿色或不变色。( (注:如选择商品化生化鉴定试剂盒

5.12)或全自动微生物生化鉴定系统

4.11),可选择7.3.

纯化后的菌落( (对应操作说明书进行试验。357.. 血清学试验353517... 肠出血性大肠杆菌O抗原鉴定351( (( ((1取出肠出血性大肠杆菌

O157诊断血清

5.13),恢复室温;取出干净载玻片( (( ((1量移液器

4.7)吸取20μL肠出血性大肠杆菌

O157诊断血清

5.18)滴加于载玻片中央;用接种环4.9)挑取营养琼脂平板上分纯单个菌落于血清中,慢慢磨开使其混匀成乳状液,静置,min后观察凝集情况。将载玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。3527... 肠出血性大肠杆菌

H抗原鉴定352( (用肠出血性大肠杆菌

H7诊断血清

5.13)代替肠出血性大肠杆菌

O157诊断血清

5.13),方法( (17.3.5.。159SN/T4656.—2023947. 结果报告4综合以上生化试验和血清学试验结果,报告样品中检出或未检出肠出血性大肠杆菌

O157:H7。H18

方法二 肠出血性大肠杆菌O157:7实时荧光PCR法H18. 原理f4根据肠出血性大肠杆菌

O157:H7特有的rbE保守序列,设计一组PCR特异性引物和荧光双标记f4探针(两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团)。PCR扩增时,反应体系中加入

DNA

模板、引物、探针、

种脱氧核苷酸酶。目标菌不存在时,探针完整,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,没有荧光信号产生;目标菌存在时,探针被

Taq酶酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条

DNA链,就有一个荧光分子形成,达到荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步,从而准确判定目标菌存在与否。28. 检测程序2检测程序见图2。H图2

肠出血性大肠杆菌O157:7实时荧光PCR法检测程序H38. 操作步骤3318.. 样品

DNA

模板的提取315 (( (( ((样品增菌参照7.3.1,取1mL增菌液,放入1.

mL灭菌离心管

4.13)内,置高速冷冻5 (( (( ((4.15)内10000r/min离心5min,吸弃上清;加入1mL灭菌双蒸水

5.14)混匀,高速冷冻离心机4.15)内10000r/min离心5min,吸弃上清;然后加灭菌双蒸水

5.14)00μL混匀,置100

℃煮沸5min,高速冷冻离心机

4.15)内10000r/min离心2min,取上清作为

DNA

模板,可-20℃存放备(用。也可使用等效的商品化DNA提取试剂盒

5.15)并按其说明操作。(6组分1管试验用量n

管试验用量10×PCR缓冲液(5.16)2.5μLn×2.5μLdNTP混合液(10mmol/L)(5.17)1.0μLn×1.0μL上游引物(10μmol/L)(5.18)1.0μLn×1.0μL下游引物(10μmol/L)(5.18)1.0μLn×1.0μL探针(10μmol/L)(5.18)1.0μLn×1.0μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)(5.19)0.5μLn×0.5μL灭菌双蒸水(5.14)16.0μLn×16.0μL总体积23.0μLn×23.0μL注:上、下游引物终浓度为0.4μmol/L,探针终浓度0.4μmol/L。9SN/T4656.—20239323218.. DNA

扩增反应323218... 扩增准备(n根据样本数量设定所需要的PCR反应管

4.14)数n(=1管空白对照+1管阴性对照+1(n对照+样本数)。扩增反应体系见表1,按表1计算各试剂的使用量,按顺序加入灭菌

PCR

反应管(24.14)内,颠倒混匀,000r/min离心10s,分装至n

个PCR反应管内,每管(2表1

反应体系 对照、表1

反应体系 对照、阴性对照、阳性对照3228... 空白

空白对照:以水代替DNA模板。1阴性对照:以水代替样品按8.3.

提取模板DNA作为PCR反应的模板。1( 1阳性对照:肠出血性大肠杆菌

O157:H7标准菌株

5.20)增菌后按8.3.

提取模板

DNA( 1段的阳性克隆分子DNA。3238... 加样32310 1将8.3.

制备好的DNA模板、空白对照、阴性对照、阳性对照各取2.

μL10 12的反应管中,使反应体系达到25μL。盖紧管盖,混匀,000r/min离心10s。23248... 扩增3243 ( 3 9 9将8.3.2.

反应管置实时荧光PCR仪

4.16)中。反应参数:7℃5min,53 ( 3 9 96 4变性5s,0℃退火延伸40s,同时收集荧光,06 448. 结果分析4418.. 质控标准41C阴性对照:无扩增曲线,t≥40.;CC阳性对照:出现典型的扩增曲线,t<30.;否则,实验视为无效。C79SN/T4656.—20239428.. 结果判定420a)

Ct≥40.,可判定样品结果为阴性,可直接报告样品未检出肠出血性大肠杆菌

O157:H7。0b)

Ct≤35.,可判定该样品结果为阳性;c)

35.0<Ct<40,建议样本重做,重做结果如Ct≥40为阴性,否则为阳性。对于阳性结果,参见方法一进行确认。58. 结果报告5根据确认结果报告样品中检出或未检出肠出血性大肠杆菌

O157:H7。9

防止污染和废弃物处理的措施应符合SN/T4656.8的规定。89SN/T4656.—20239附 录

A(规范性)培养基和试剂1A. 培养基制备及质量保证12按SN/T1538.

和SN/T1538.

制备培养基并进行性能测试,如使用等效商品化脱水合成培养2基,使用前对其进行验收并按其说明书使用。2 (21A. 改良胰蛋白胨大豆肉汤

2 (21A.. 成分0055000胰酪蛋白胨 17.g0055000大豆蛋白胨 3.gD-葡萄糖 2.g3号胆盐 1.氯化钠 5.g磷酸氢二钾 4.g新生霉素钠盐溶液 1.

mL蒸馏水 1000mL22A.. 制法2221除新生霉素钠盐溶液外,准确称取其余成分混合加入1000mL蒸馏水中,加热溶解,室温调节21至7.0±0.,21℃高压灭菌15min。取出冷却至50℃以下时,加入1mL新生霉素钠盐溶液,混匀备用。3 C31 S311A. 改良山梨醇麦康凯3 C31 S311A..山梨醇麦康凯(MAC)琼脂A... 成分050蛋白胨 20.g050氯化钠 5.g山梨醇 10.g3号胆盐 1.g琼脂 15.g中性红0.3g结晶紫 0.01g蒸馏水 1000mL312A... 制法312除琼脂、中性红、结晶紫外,准确称取其余成分混合加入1000mL蒸馏水中,加热溶解,室温调节1pH

至7.2±0.,加入琼脂、中性红、结晶紫,煮沸溶解,21℃高压灭菌15min。199SN/T4656.—2023932321A..亚碲酸钾溶液32321A... 成分5亚碲酸钾 0.g5蒸馏水 200mL322A... 制法322准确称取亚碲酸钾溶于蒸馏水中,过滤除菌备用。33331A.. 头孢克肟溶液33331A... 成分0头孢克肟 1.

mg095%乙醇 200mL332A... 制法332将头孢克肟溶解于95%乙醇中,静置1h待其充分溶解后过滤除菌。分装试管,储存于-20℃,有效期1年。解冻后的头孢克肟溶液不易在冻存,且在0℃~4℃下存放有效期2周。34A.. CT-SMAC平板制备34取1000mL灭菌融化并冷却至46℃的SMAC琼脂,加入1mL亚碲酸钾溶液和10mL头孢克肟溶液,混匀后倾注平板。441A. 营养琼脂441A.. 成分000蛋白陈 10.g000牛肉膏 3.g氯化钠 5.g琼脂 15.g蒸馏水 1000mL42A.. 制法421 1将上述成分混合后,加热溶解,室温调pH7.4±0.,分装到玻璃容器内,21℃高压灭菌201 1平板倾注15mL~20mL琼脂,备用。551A. 吲哚培养基551A.. 成分00蛋白胨 10.g00氯化钠 5.gDL-色氨酸 1.g蒸馏水 1000mL109SN/T4656.—2023952A.. 制法52521 /522A... 准确称取除DL-色氨酸外其他成分加入1000mL蒸馏水中,搅拌均匀,静置约10521 /522A...准确称取DL-色氨酸加入约4mL1molL氢氧化钠溶液中,完全溶解。523 4 1 1A...将两液进行混合,加热煮沸至完全溶解,调pH7.

±0.,分装试管(523 4 1 15 1管1.

mL,21℃高压灭菌15min,5 1661A. 柯凡克试剂661A.. 成分对二甲氨基苯甲醛 10.g戊醇 150mL浓盐酸 50mL62A.. 制法62准确称取对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,缓慢搅拌加入盐酸,加热至60℃,呈深黄色,静置6h~7h,变成黄色即可使用。771A.MR-VP培养基771A.. 成分000胨 7.g000葡萄糖 5.g磷酸氢二钾 5.g蒸馏水 1000mL72A.. 制法722 1称取各成分溶于水中,加热溶解,调pH6.9±0.,分装试管,21℃高压灭菌152 1881A. 甲基红试剂881A.. 成分1甲基红 0.g195%乙醇 300mL82A..