来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质

480480ChineseJournalofBiotechnology/cjbcn周传华等/来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质April25,2013,29(4):480-489©2013ChinJBiotech,Allrightsreserved工业生物技术工业生物技术来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质2中国科学院天津工业生物技术研究所工业酶国家工程实验室，天津30周传华,陈曦,冯进辉,等.来源于葡萄球菌N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质.生物工程学报,2013,29(4):480-489.ZhouCH,ChenX,FengJH,etal.MolecularcloningandcharacterizationofaN-acetylneuraminatelyasegenefromStaphylococcushominis.ChinJBiotech,2013,29(4):480-489.摘要:葡萄球菌Staphylococcushominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal(GenBankAccessionNo.EFS20452.1)构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45℃。在45℃下孵育2h对ShNAL的活力基本无影响，高于45℃时，活力迅速下降。该酶在pH5.0~10.0的环境中比较稳定，4℃下放置24h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺(Man)和丙酮酸(Pyr)的Km值分别是(4.0±0.2)mmol/L、(131.7±12.1)mmol/L和(35.1±3.2)mmol/L，kcat/Km值分别为1.9L/(mmol·s)、0.08L/(mmol·s)和0.08L/(mmol·s)。关键词:葡萄球菌，N-乙酰神经氨酸裂合酶，表达，纯化，生物催化Received:September19,2012;Accepted:November30,2012Supportedby:NationalBasicResearchProgramofChina(973Program)(No.2011CB710801).Correspondingauthor:QiaqingWu.Tel/Fax:+86-22-84861963;E-mail:wu_qq@DunmingZhu.Tel/Fax:+86-22-86841962;E-mail:zhu_dm@国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2011CB710801)资助。481周传华等/来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质481MolecularcloningandcharacterizationofaN-acetylneuraminatelyasegenefroChuanhuaZhou1,2,XiChen2,JinhuiFeng2,DongguangXiao1,QiaqingWu2,2NationalEngineeringLaboratoryforIndustrialEnzymes,TianjinInstituteofIndustrialBiotechnology,ChineseAcademyofSciences,Abstract:AN-acetylneuraminatelyasegene(shnal)fromStaphylococcushominiswasclonedintopET-28aandexpressedinEscherichiacoliBL21(DE3)hostcells.Therecombinantenzymewaspurifiedandcharacterized.ItisahomotetramericenzymewiththeoptimumpHat8.0forthecleavagedirectionandtheoptimumpHandtemperaturewere7.5and45°Cforthesyntheticdirection.TheactivityofShNALisstablewhenincubatedat45°Cfor2hbutdecreasedrapidlyover50°C.ShNALshowedhighstabilityinawiderangepHfrom5.0to10.0withtheresidualactivitybeing>70%whentheenzymewasincubatedindifferentbuffersat4°Cfor24h.ItsKmtowardsN-acetylneuraminicacid,pyruvateandManNAcwere(4.0±0.2)mmol/L,(35.1±3.2)mmol/Land(131.7±12.1)mmol/L,respectively.Thekcat/KmvalueofNeu5Ac,ManNAc,andPyrforShNALwere1.9L/(mmol·s),0.08L/(mmol·s)and0.08L/(mmol·s),respectively.Keywords:Staphylococcushominis,N-acetylneuraminatelyase,expression,purification,bi羟醛缩合反应是指含有活性“氢原子的化合羰基化合物发生亲核加成，得到β-羟基醛酮或酸。羟醛缩合反应形成新的碳-碳键，是有机合成中极为重要的一类反应[1]。目前实现不对称羟醛缩合反应的化学方法主要有添加手性助剂[2]或用手性路易斯酸[3]、有机小分子[4-6]等进行催化。相对于化学催化法，应用生物催化剂实现羟醛缩合反应具有反应条件温和、绿色无污染、底物立体选择性强等优点，在工业上具有良好的应用前景。N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是某些复合糖抗菌等多方面有生物学活性，是合成抗病毒试剂扎那米韦(Zanamivir)的重要中间体[7]，在生物N-乙酰神经氨酸裂合酶(N-Acetyl-D-neuraminicacidlyase，EC简称NAL)是裂合酶酶既可以将N-乙酰神经氨酸(简称Neu5Ac)裂解成N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸(Pyr)，又能催化ManNAc和Pyr羟醛缩合生成N-乙酰神经氨酸[8](图1)。NAL在微生物界的分布非常广泛，多种微生物中都曾检测到该酶的活性[9-11]，其中来源于大肠杆菌Escherichiacoli[12Clostridiumperfringens[15]、嗜血杆菌属Haemophilusinfluenza[16]、Trichomonasvaginalis[17]、巴氏杆菌属Pasteurellamultocida[18]和乳杆菌属Lactobacillusplantarum[19]的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因已经cjb@482ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2013Vol.29No.4482HONHAcHOHOManNAcOHNALOHpyuvateOHOHHOOHHOCOOHHOCOOHACHNHONeu5Ac图1酶法合成Neu5Ac的图示[8]Fig.1EnzymaticsynthesisofN-acetylneuraminicacid(Neu5Ac)fromN-acetyl-D-mannosamine(ManNAc)andpyruvate(Pyr)catalyzedbyN-acetylneuraminatelyase(NAL)[8].是通过乳酸氧化酶全细胞催化将乳酸转化成丙生物催化合成Neu5Ac的反应中，最为关键的是更有利于合成反应的N-乙酰神经氨酸裂合酶，可以更高效地合成Neu5Ac，我们通过基因挖矿选择了几个不同来源的基因作为研究对象，经过初步的研究发现来源于葡萄球菌Staphylococcushominis的N-乙酰神经氨酸裂合酶的活性较高，对该酶的性质进行了较详细的研究。1.1材料1.1.1菌株和质粒菌株E.coliTrans5“由本实验室保存，pET28a(+)载体和E.coliBL21(DE3)均购自Novagen公司。通过基因挖矿获得候选基因，序列信息来源于NCBI数据库(GenBankAccessionNo.EFS20452.1)，全基因序列由上海旭冠生物科技发展有限公司合成。BCA蛋白浓度试剂盒购自康为世纪公司酸和乳酸脱氢酶(LDH)购自Sigma公司；考马内切酶NdeⅠ和XhoⅠ以及T4DNA连接酶均购1.2序列分析(CLUSTAL-W)完成，对蛋白的理化性质初步预测通过网站进行(/admin/users/login)。1.3工程菌的构建基因的诱导表达等实验操作均按照《分子克隆实验指南》[21]进行。DNA胶回收按照胶回收试剂盒(Tiangen公司)说明书进行。目的基因shnal构建至pET-28a质粒的NdeⅠ和XhoⅠ两酶切位1.4目的蛋白的表达及纯化将工程菌接入800mLLB培养基(含终浓度异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4~6h。菌液6000r/min离心10min，生理盐水/cjbcn483周传华等/来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质483将细胞重悬到100mL含5％甘油，500mmol/LNaCl的Tr12000r/min、4℃离心30上清用0.45μm的滤膜过滤后通过蛋白纯化仪(Purifier10，GE公司)在室温下用镍柱纯化(填缓冲液(20mmol/L，pH8.0)线性洗脱目的蛋定，牛血清白蛋白BSA作为标准蛋白。ShNAL在溶液中的聚集状态通过凝胶层析以及SDS来进行确定。所用层析柱为Superdex20010/300GL，Gelfiltrationcalibrationkit(GE)用于标准分子量测定。流动相为含150mmol/LNaCl的20mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)，流速为0.4mL/min。蛋白的分子量大小通过和标准蛋白的保留体积标准曲线进行比(43.0kDa)，Conalbumin(75.0kDa)，Conalbumin(158.0kDa)，Ferritin(440.0kDa)，Thyroglobulin(669.0kDa)。1.5活性的测定1.5.1裂解方向裂解方向的活性通过酶标仪(SpectraMax是：N-乙酰神经氨酸裂解生成的丙酮酸能在NADH和乳酸脱氢酶存在的条件下被还原成乳酸，过程中消耗了NADH，引起340nm波长下对NADH的吸光度的下降[22-23]。一个酶活力单的Neu5Ac生成1μmol的N-乙酰-D丙酮酸所需酶的量。反应体系包括10mmol/L0.85μgShNAL，反应在常温下不同pH的100mmol/L的缓冲液中进行。1.5.2合成方向合成方向的活性通过HPLC测定，其原理为：仅加入ManNAc、Pyr和酶，通过HPLC检1μmolNeu5Ac所需要的酶量。反应体系包括1.6酶的性质分析合成和裂解方向的最适反应pH测定是在冲体系选用醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0~6.0)，磷酸盐缓冲液(pH6.0~8.0)，Tris-HCl缓冲液(pH8.0~9.0)，碳酸盐缓冲液(pH9.0~11.0)，裂解方向的反应温度为室温，合成方向的反应温度的测定是将反应放入20℃~65℃的环境中进行1.7酶的稳定性研究和动力学参数测定温度耐受性测定是将酶稀释到pH7.0的cjb@484ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2013Vol.29No.448424h，测定裂解方向的残留活性。Neu5Ac浓度下的活性，反应在pH8.0的缓冲液中进行。在合成方向，反应在pH7.5的缓冲液N-乙酰甘露糖胺的浓度为30mmol/L，测定不同Pyr浓度下酶的活力；测定N-乙酰甘露糖胺的定N-乙酰甘露糖胺不同浓度下的酶活。1.8HPLC分析条件生产的型号为AminexHPX-87H糖分析柱1.9合成产物的分离和鉴定20mL的Tris-HCl(100mmo200r/min条件下反应20h，通过离心除去菌体，100℃加热除去蛋白终止反应。反应的转化率通过阴离子交换树脂(201×7)分离方法[20]纯化。2.1氨基酸序列分析将来源于Staphylococcushominis与其他菌属来源的N-乙酰胺神经氨酸裂合酶氨基酸序列进行比较(图2)，发现ShNAL与已知的N-乙酰胺神经氨酸裂合酶，与来源于Haemophilusinfluenza[16]、Clostridiumperfringens[15]、Trichomonasvaginalis[17]和Lactobacillusplantarum[19](GenBankAccessionNo.分别是10102030405060708090100shNAL1LPNALCPNAL1TrNALECNAL1110120130140150160170180190200shNAL77LPNAL75CPNAL73TrNAL101HiNAL76ECNAL76210220230240250260270280290300shNAL76310320shNAL274LPNAL272CPNAL270TNAL299HiNAL274ECNAL275LPNAL74CPNAL172TrNAL200HiNAL175ECNAL176HiNAL图2ShNAL与已知的N-乙酰神经氨酸裂合酶序列的比对结果Fig.2MultiplesequencealignmentforShNALandrelatedN-acetylneuraminatelyases./cjbcn485周传华等/来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质485P44539.1，Q9S4K9.2，AABNP_786769.1)的同源性分别为58％、56％、53％和50％，而与来源于Escherichiacoli[11]ShNAL拥有NAL亚家族活性位点的关键残基酸位点编号，下同)位点、保守的GxxGE底物专一性结合框架(第47~51个氨基酸)以及两个氨基酸位点(48、49位)是S/S，这两个连续的氨基酸与Y137和水分子共同参与形成丙酮合位点。保守区域外的位点有较大差异。2.2重组酶的纯化通过镍柱亲和层析一步纯化得到电泳纯的裂解方向的比活达到了24.8U/mg(表1)，在3.1U/mg。用胶过滤层析测定ShNAL的确定分子量为125kDa，其单体分子量为33.8kDa，因此该酶在溶液中以四聚体形式存在。2.3酶的最适反应pH和温度降到最高时的17.5％(图4)。合成方向的最适反pH9.0的碳酸盐缓冲液中该酶仍然能保持最高活力的95％以上(图5)。通过对ShNAL合成方向的最适反应温度研究发现，在20℃~45℃之最大活力，当温度超过50℃时酶活迅速下降(图6)。温度对裂解方向酶活性影响的研究表明图3SDS分析ShNAL的纯化Fig.3SDSanalysisofthepurifiedShNAL.1:proteinmarker;2:cell-freeextractwithoutinduction3:crudecell-freeextract;4:purifiedShNAL.表1ShNAL蛋白纯化表Table1PurificationofShNALPurificationPurificationstep Specificactivity(U/mg) PurificationfactorCrudecell-freeextract957.74.4His-trapaffinitychromatography24.8cjb@486ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2013Vol.29No.4486图4pH对裂解方向酶活性的影响Fig.4EffectofpHonShNALactivityforthecleavagedirection.Aceticacidbuffer(pH4.0to6.0),phosphatebuffer(pH6.0to8.0)andTris-HClbuffer(pH8.0to9.0)wereused.图5pH对合成方向酶活性的影响Fig.5EffectofpHonShNALactivityforthesyntheticdirection.Acetatebuffer(pH4.0to6.0),phosphatebuffer(pH6.0to8.0),Tris-HClbuffer(pH8.0to9.0)andcarbonatebuffer(9.0to10.0)wereused.升高而不断提高。2.4酶的稳定性通过测定裂解反应活性变化来研究ShNALpH5.0~10.0范围内ShNAL的残留活性能保持碱环境都能使酶失活(图7)。通过测定裂解方向活性损失对ShNAL的热图6温度对合成反应酶活性的影响Fig.6EffectoftemperatureonShNALactivityforsyntheticreaction.图7pH的耐受性测定Fig.7pHstabilityofShNAL.Acetatebuffer(pH5.0to6.0),phosphatebuffer(pH6.0to8.0),Tris-HClbuffer(pH8.0to9.0)andcarbonatebuffer(pH9.0to11.0)wereused./cjbcn487周传华等/来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质487没有下降，说明酶在30℃的稳定性良好，而当2.5动力学参数的测定测定合成和裂解两个方向的动力学参数，裂解方向的Neu5Ac的Km值为(4.0±0.2)mmol/L，合成方向的ManNAc和Pyr的Km值分别为(131.7±12.1)mmol/L和(35.1±3.2)mmol/L。Neu5Ac、Pyr和ManNAc的kcat/Km值分别为Neu5Ac、Pyr的Km值与目前报道的来源于其他菌属的N-乙酰神经氨酸裂合酶相差不大，ManNAc的Km值比其他来源的酶都要小。ShNAL与之前研究的动力学相关参数比较见表的相关酶要低，而合成方向的催化效率kcat/Km与它们相当，可能更有利于合成反应进行。2.6合成产物的分离和鉴定通过HPLC检测反应转化率为91.5%,Neu5Ac的产率达到了89.4％(图9)。反应液经图8温度耐受性研究Fig.8ThermalstabilityofShNAL.Enzymewasincubatedatcertaintemperatureandmaintainforthreedifferenttimes.Activityofenzymestoredin4°Cwassetas100%relativeactivity.表2ShNAL与之前报道的不同来源的酶的动力学参数比较[18-19]Table2KineticparametersofrecombinantShNALandotherpreviouslydescribedEnzymesEnzymesActivitiesSubstratesKm(mmol/L) kcat/Km(L/(mmol·s))LpNALCleavageNeu5AcsynthesisCleavageNeu5AcManNAcPyruvateNeu5Ac2.5±0.30.030.114.00 EcNALNeu5AcsynthesisCleavageManNAcPyruvateNeu5Ac22.0±1.04.9±0.70.050.08 PmNALNeu5AcsynthesisCleavageManNAcPyruvateNeu5Ac220.0±30.023.0±1.04.0±0.20.050.08Neu5AcsynthesisManNAcPyruvate35.1±3.20.080.08cjb@488ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechApril25,2013Vol.29No.4488图9Neu5Ac的HPLC图谱(A：NeuAc标准样品；B：ShNAL催化的反应；C：NeuAc标样和反应物的混合物)Fig.9HPLCfingerprintspectrumofNeu5Ac.(A)NeuAcstandardsample.(B)Reactionsystem.(C)MixtureofNeu5Acstandardsampleandthereactant.处理上样0~0.2mol/L甲酸洗脱的样品通过减压谱检测结果：MS(ES-)计算值C11H19NO9(308.10，实验值307.82。目前，国内还没有利用分离纯化的N-乙酰神经氨酸裂合酶合成Neu5Ac的工业化生产的报道，限制Neu5Ac工业化生产的因素很多，如生产原料ManNAc非常昂贵外，醛缩酶(或裂解酶)的活性低等也是重要的原因。有效的解决途径可能是通过异构酶将相对廉价的N-乙酰葡萄糖胺转化成ManNAc，再在高活性的N-乙酰神经氨酸裂合酶催化下来合成Neu5Ac。本研究克隆并表达了来自Staphylococcushominis的潜在N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal，研究了纯化酶的酶学性质和动力学参数，Km值最小，kcat/Km值为0.08L/(mmol·s)，优于之前研究过的0.05L/(mmol·s)的最大值；在pH9.0的环境中，ShNAL在合成方向仍能保持合成反应最适pH下活力的95而裂解方向的活性降至最适pH下活力的17.5偏碱性条件更利于产物合成。综合以上特点，ShNAL在合成反应中具有一定的优势，但是酶的催化活性有待进一REFERENCES[1]PalomoC,OiarbideM,GarciaJM.Currentprogressintheasymmetricaldoladditionreaction.ChemSocRev,2004,33(2):65-75.[2]EvansDA,BartroliJ,ShihTL.Enantioselectivealdolcondensations.2.Erythro-selectivechiralaldolcondensationsviaboronenolates.JAmChemSoc,1981,103(8):2127-2129.[3]MachajewskiTD,WongCH.Thecatalytic/cjbcn489周传华等/来源于葡萄球菌的N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因克隆及性质489asymmetricaldolreaction.AngewChemIntEdit,2000,39(8):1352-1374.[4]CórdovaA,ZouW,DziedzicP,etal.Directasymmetricintermolecularaldolreactionscatalyzedbyaminoacidsandsmallpeptides.ChemEurJ,2006,12(20):5383-5397.[5]DalkoPI,MoisanL.Inthegoldenageoforganocatalysis.AngewChemIntEdit,2004,43(39):5138-5175.[6]NotzW,TanakaF,BarbasCF.Enamine-basedorganocatalysiswithprolineanddiamines:thedevelopmentofdirectcatalyticasymmetricaldol,Mannich,Michael,andDiels-Alderreactions.AccChemRes,2004,37(8):580-591.[7]VonItzsteinM,WuWY,KokGB,etal.Rationaldesignofpotentsialidase-basedinhibitorsofinfluenzavirusreplication.Nature,1993,363(6428):418-423.[8]Groher,A.andHoelschK.MechanisticmodelforthesynthesisofN-acetylneuraminicacidusingN-acetylneuraminatelyasefromEscherichiacoliK12.JMolCatalB:Enzym,2012,83(0):1-7.[9]HeimerR,MeyerK.Studiesonsialicacidofsubmaxillarymucoid.ProcNatlAcadSciUSA,1956,42(10):728-734.[10]PopenoeEA,DrewRM,KeeL.TheactionofanenzymeofClostridiumperfringensonorosomucoid.JBiolChem,1957,228(2):673-683.[11]YoshihirU,YojiT,TsunetakeS.DistributionofN-acetylneuraminatelyaseinbacteriaanditsproductionbyEscherichiacoli.AgricBiolChem,1985,49(1):181-187.[12]AisakaK,UwajimaT.CloningandconstitutiveexpressionoftheN-acetylneuraminatelyasegeneofEscherichiacoli.ApplEnvironMicrobiol,1986,51(3):562-565.[13]OhtaY,WatanabeK,KimuraA.CompletenucleotidesequenceoftheE.coliN-acetylneuraminatelyase.NucleicAcidsRes,1985,13(24):8843-8852.[14]OhtaY,ShimosakaM,MurataK,etal.MolecularcloningoftheN-acetylneuraminatelyasegeneinEscherichiacoliK-12.ApplMicrobiolBiotechnol,1986,24(5):386-391.[15]TravingC,RoggentinP,SchauerR.Cloning,sequencingandexpressionoftheacylneuraminatelyasegenefromClostridiumperfringensA99.GlycoconjJ,1997,14(7):821-830.[16]LilleyGG,BarbosaJA,PearceLA.ExpressioninEscherichiacolioftheputativeN-acetylneuraminatelyasegene(nanA)fromHaemophilusinfluenzae:overproduction,purification,andcrystallization.ProteinExprPurif,1998,12(3):295-304.[17]MeysickKC,DimockK,GarberGE.MolecularcharacterizationandexpressionofaN-acetylneuraminatelyasegenefromTrichomonasvaginalis.MolBiochemParasitol,1996,76(1/2):289-292.[18]LiY