第13章DNA复制教学课件

中心法则生物的遗传信息从DNA传递给DNA的过程称为复制，由DNA传递给mRNA的过程称为转录。根据mRNA链上的遗传信息合成蛋白质的过程，被称为翻译。转录和翻译共称为表达。1958年Crick将生物遗传信息的这种传递方式称为中心法则。1970年Temin提出“逆转录”概念，丰富了中心法则的内容。ReversetranscriptionDNA生物合成复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication

第一节子链继承母链遗传信息的几种可能方式

全保留式半保留式混合式复制的特点：复制的方式

——半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)复制的方向：双向或单向复制半不连续复制(semi-discontinuousreplication)一、半保留复制的实验依据和意义DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA

复制过程中形成的复制叉子代DNA

密度梯度实验

——实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液

第一代继续培养于普通培养液

第二代梯度离心结果按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。也有的生物的单向复制。二、复制方向复制中的放射自显影图象A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制子3’三、复制的半不连续性3535解链方向3´5´3´3´5´前导链(leadingstrand)随从链(laggingstrand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为冈崎片段(okazakifragment)。

前导链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

冈崎片段与半不连续复制（okazaki1968年）复制的引物为什么需要引物？引物为RNA（体外复制为DNA）DNA复制后引物的去除和空隙填补

DNA复制的酶学TheEnzymologyofDNAReplication第二节参与DNA复制的物质底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):

解开成单链的DNA母链引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合Mg2+

其他的酶和蛋白质因子一、复制的化学反应

(dNMP)n

+dNTP→(dNMP)n+1

+PPi

聚合反应的特点DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5→3方向进行。二、DNA聚合酶全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53

的聚合活性

2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA

3´

|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´35外切酶活性53外切酶活性?能切除突变的DNA片段,DNA修复。能辨认错配的碱基对，并将其水解。

核酸外切酶活性（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ（一）原核生物的DNA聚合酶

酶作用DNA聚合酶Ⅰ5‘－3’聚合酶及外切酶作用，3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修复DNA链，还可切除引物DNA聚合酶Ⅱ5‘－3’聚合酶及3‘－5’外切酶酶作用，可校正/修复DNA链DNA聚合酶Ⅲ与酶Ⅰ作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶replicase）功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。DNA-polⅠ（109kD）323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。

功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ(250kD)（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol（二）真核生物的DNA聚合酶三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读

（二）复制的保真性和碱基选择（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-polI不表现活性。（二）复制的保真性和碱基选择•DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。•嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制

四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白E.Coli基因图解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

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局部解链后（二）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)

解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键

拓扑异构酶Ⅰ

拓扑异构酶Ⅱ分类：拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制

五、DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式HO5’3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能DNA复制过程TheProcessofDNAReplication第三节（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成

E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245

串联重复序列

反向重复序列53531.DNA解链DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB35352.引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶（二）复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol前导链的合成随从链的合成阶段一阶段二阶段三阶段四复制过程简图原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）复制的终止555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶

随从链上不连续性片段的连接哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成

•细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。•蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。•真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。•复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。•增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始3553领头链3535亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止53355335+5333355端粒(telomere)

指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能：•维持染色体的稳定性•维持DNA复制的完整性结构特点：•由末端单链DNA序列和蛋白质构成。•末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG…端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

组成：端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工逆转录和其他复制方式ReverseTranscription&OtherDNAReplicationWays第四节逆转录酶(reversetranscriptase)逆转录(reversetranscription)RNADNA

逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶

逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA逆转录酶

AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNAcDNAcomplementaryDNA二、逆转录研究的意义

逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

滚环复制(rollingcirclereplication)三、滚环复制和D环复制

是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。3-OH5-P55533335'滚环复制5'5335dNTPDNA-polγ

D环复制(D-loopreplication)

是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。

DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)&Repair第五节遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。

一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础

二、引发突变的因素物理因素：紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射

UV化学因素：三、突变的分子改变类型错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)

框移(frame-shift)

DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

2.颠换（一）错配镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)β亚基N-val

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his

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glu

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C肽链CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亚基N-val

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glu

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C肽链CTCGAG基因（二）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列