DB6501T044-2023动物源肺炎克雷伯菌检验

ICS11.220CCSICS11.220CCSB41乌 鲁 木 齐 市 地 方 标 准DB6501/T044—2023动物源肺炎克雷伯菌检验ExaminationofKlebsiellapneumoniaeofanimalorigin202320230525202306-01乌鲁木齐市市场监督管理局发布目 次前言 III1范引文件 1语定义 1备材料 1养和剂 2要求 2培基 2试剂 2准株 2物全求 3品集保运输 3鼻子直肠/腔拭子 3生乳品 3组样品 3验序 34离化 4兰染镜检 44生鉴定 4质鉴定 5PCR鉴定 5果报告 6株藏 6附录A（范）培基和剂 7营肉（NB） 7麦凯醇东苄青素脂（MIAC） 7营琼（NA） 7羧青素 8氧酶验剂 8无菌0.85%理水 85%糖脂保剂 8附录B（料）肺克雷菌Khe因PCR增目片测序列 10前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心提出。本文件由乌鲁木齐市农业农村局（乌鲁木齐市乡村振兴局）归口并组织实施。（本文件实施应用中的疑问，请咨询乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心。号）。号）468588303动物源肺炎克雷伯菌检验范围（Klebsiella本文件适用于动物鼻拭子、直肠/泄殖腔拭子、生鲜乳、组织等样品中肺炎克雷伯菌的检验。（GB19489实验室生物安全通用要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae0.5µm～0.8µm～2µm,4设备和材料冰箱：2℃～8℃，-20℃或以下；恒温培养箱：36℃±1℃；电子天平：感量10mg；全自动微生物生化鉴定系统；基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）；PCR仪；二级生物安全柜；显微镜；核酸电泳仪:配水平电泳槽；电泳凝胶成像分析系统；高压灭菌器；电热炉；pH计或精密pH试纸。微量移液器5培养基和试剂要求GB/T6682A培养基（NB）A.1（MIAC）A.2营养琼脂：见附录A.3A.4试剂5.3.15.3.25.3.35.3.4商品；5.3.55.3.65.3.75.3.85.3.95.3.105.3.115.3.12羧苄青霉素：见附录A.5，商品化羧苄青霉素溶液则按说明书配制；革兰氏染色液：商品化革兰氏染色液套装；生化鉴定卡（全自动微生物生化鉴定系统用）或商品化生化鉴定试剂；基质液（飞行时间质谱仪用）：取α-氰-4-羟基肉桂酸(HCCA)，按说明书配制溶液；或用市售氧化酶试剂：见附录A.6；0.85%生理盐水：见附录A.7；5%蔗糖脱脂乳保护剂：见附录A.8；聚合酶链式反应预混液（2×PCRMasterMix）；TAE缓冲液；琼脂糖；甘油；碘伏。6标准菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603。PCR鉴PCR鉴实验室设施设备、人员防护、实验安全操作、实验废弃物及菌株处理应符合GB19489的要求。鼻拭子、直肠/泄殖腔拭子5mL～10mL0℃～424。生鲜乳样品先用消碘伏擦拭消毒动物乳头及周边，弃前3把乳汁，挤取10mL～20mL乳汁于无菌容器。0℃～4℃保存、运输，不宜超过24h。若超过24h，-20℃冷冻保存、运输。10mL～20mL0℃～4℃保2424h，-20组织样品组织样品0℃～4h24h，-209检验程序肺炎克雷伯菌检验程序见图1。样品营养肉汤36℃±1℃，18h～24h麦康凯肌醇阿东醇羧苄青霉素琼脂可疑落 36℃±1℃，18h～24营养36℃±1℃，18h～24h革兰氏染色镜检生化定 质谱定肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌图1肺炎克雷伯菌检验程序增菌36℃±1℃培养18h～24h1mL～2mL5mL～10mL36℃±1℃培养18h；1g～25mL～10mL36℃±1℃培养18h～24h。，36℃±1℃培养18h～24h，36118h～24h。挑取营养琼脂平板上培养的纯化菌落进行革兰氏染色镜检。肺炎克雷伯菌为革兰氏染色阴性短杆挑取营养琼脂平板上培养的纯化菌落进行革兰氏染色镜检。肺炎克雷伯菌为革兰氏染色阴性短杆菌，单个、成双或成短链排列，有荚膜。符合镜检特征的可疑菌落进行下一步鉴定。13鉴定生化鉴定、质谱鉴定、PCR鉴定3种方法任选其一。生化鉴定挑取纯培养的菌落进行肺炎克雷伯菌生化鉴定，全自动微生物生化鉴定系统或手工操作生化鉴定试剂（表1）均按其说明书进行操作和结果判定。表1肺炎克雷伯菌生化特性试验项目肺炎克雷伯菌肺炎亚种肺炎克雷伯菌臭鼻亚种动力试验---氧化酶试验---尿素酶+d-MR-++VP+--西蒙氏枸橡酸盐+d-试验项目肺炎克雷伯菌肺炎亚种肺炎克雷伯菌臭鼻亚种D-酒石酸盐d--丙二酸盐+-+ONPG++-赖氨酸脱羧酶+d-分解葡萄糖产气+d-乳糖+d-卫矛醇d--靛基质---注：“+”≥90%阳性，“+/-”75%～88%阳性，“d”为不定，“-/+”75%～89%阴性，“-”≥90%阴性。质谱鉴定13.2.1菌样制备溶液滴于样品上，混匀，室温干燥。检测样品前，应对飞行时间质谱仪进行校准。测定取制备好的样品靶板，置质谱仪钯靶板中，编辑样品信息后，进行谱图的数据采集。溶液滴于样品上，混匀，室温干燥。检测样品前，应对飞行时间质谱仪进行校准。测定取制备好的样品靶板，置质谱仪钯靶板中，编辑样品信息后，进行谱图的数据采集。B.1。PCR鉴定0.5mL10min,12000r/min2min引物针对肺炎克雷伯菌溶血酵素基因（khe），引物序列为上游5′-TGATTGCATTCGCCACTGG-3′，下游5′-GGTCAACCCAACGATCCTG-3′,扩增长度428bp。扩增PCR反应体系（25µL）：2×PCRmasterMix12.5µL，上游引物（10µmoL/L）0.5µL，上游引物（10µmoL/L）0.5µL，水10.5µL，模板1µL。PCR反应条件：95℃5min;95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环;72℃10min，扩增结束后4℃保存。电泳取PCR扩增产物,于2%的琼脂糖凝胶中电泳,凝胶成像分析。428bpNCBI/BLAST工具菌。根据检验结果报告样品中检出或未检出肺炎克雷伯菌。5%5%20℃或以下保藏。附录A（）（NB）成分蛋白胨 10.0g牛肉粉 3.0g氯化钠 5.0g水 1000mL制法将A.1.1成分溶解于水中，调节pH值至7.2±0.2（25℃），121℃高压灭菌15min，备用。（MIAC）成分蛋白胨 20.0g肌醇5.0g阿东醇5.0g氯化钠5.0g猪胆盐5.0g琼脂琼脂中性红结晶紫水15.0g0.05g0.001g1000mLA.2.2制法将A.2.1pH1550℃左右时，每200mL20mg（NA）成分蛋白胨牛肉粉氯化钠琼脂水10.0g3.0g5.0g15.0g1000mLA.3.2制法将A.3.1成分加热溶解于水中，调节pH值至7.3±0.1（25℃），121℃高压灭菌15min，备用。成分胰蛋胨 10.0g氯化钠 5.0g琼脂 5.0g水 1000mL制法将A.4.1加热溶解于水中，调节pH至7.4±0.1，分装试管，121℃高压灭菌15min，直立凝固，备用。成分羧苄青霉素钠制法将羧苄青霉素钠溶于水中，使有效浓度为20mg/mL，-20℃，避光储存，保质期12个月。成分四甲基对苯二胺1.0g蒸馏水 100mL制法2℃～8d无菌0.85成分氯化钠蒸馏水8.5g1000mLA.7.2制法氯化钠加入1000mL蒸馏水中，搅拌至完全溶解，分装，121℃灭菌15min，备用。5%成分脱脂乳10.0g蔗糖 5g水 100mLA.8.2制法取A.8.1各成分，混合，112℃高压灭菌15min，备用。附录B（资料性）肺炎克雷伯菌Khe基因PCR扩增目标片段测序序列GGTCAACCCAACGATCCTGGCGCGTCGCGGCATAGCCGGGATTGAGCGGGTAATAAATGCGGTTGTACTTCTTGTTGGCCTCGCCCACCACCAGCAGACGAACTTCCTGCTCGGTGTTATTGAGAAAGGTGTGGCAGATGCCGGTACCAGCGGGAAAACCCACGCTGTCGCCGGGCTCCAGCTTCCAGAGATAGCCGTTTATCCACACTTCCGGATAGCCCTCCAGCACGTA