第三章细胞分离技术

第三章细胞分离技术第1页，课件共61页，创作于2023年2月部分微生物胞内酶第一节细胞分离第2页，课件共61页，创作于2023年2月胞内重组药物

设计试验，请用生物工程学的原理和方法生产治疗糖尿病的胰岛素？第3页，课件共61页，创作于2023年2月

分离胞内产物与胞外产物的差别是什么？为回收和提纯胞内产品,必须先将它们从胞内释放到胞外,然后进行分离纯化。可以采用分泌性宿主使胞内产物直接分泌到胞外;也可用破碎细胞的方法使其释放出来。第4页，课件共61页，创作于2023年2月细胞与液体物质的分离又称为固液分离，固液分离方法包括过滤与离心沉降。一、过滤指利用多孔性介质截流固体悬浮液中的固体颗粒，进行固液分离的方法。过滤不但是传统的化工单元，而且是目前工业生产中用于分离细胞和不溶性物质的主要方法。第5页，课件共61页，创作于2023年2月过滤一般过滤：微生物、动植物细胞膜过滤：蛋白质等物质的选择性分离一般过滤：以压力差作为推动力。第6页，课件共61页，创作于2023年2月二、离心沉降沉降法：指固体颗粒在外力作用下与液体物质做相对运动最终实现固液分离的技术。沉降法根据作用外力的不同，可分为重力沉降和离心沉降。第7页，课件共61页，创作于2023年2月离心沉降是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提取条件。1）离心沉降的原理：固体和液体之间存在一定的密度差，且固体密度大于液体的密度。2）影响离心沉降速度的因素密度差、颗粒大小、液体粘度、离心力大小第8页，课件共61页，创作于2023年2月斯托克斯公式：u=d2(ρs－ρ)rω2/18μ1)密度差越大(ρs－ρ)，离心沉降速度越快；2)固体颗粒尺寸越大，越容易离心;3)液体粘度μ越大，越不容易离心；4)离心力rω2的大小对固液分离影响很大。第9页，课件共61页，创作于2023年2月3）离心机的分类分离因数Fr＝rω2／g分离因数Fr的大小分为1)Fr＜3000常速离心机2)Fr＝3000～5000中速离心机3)Fr≥5000高速离心机4)Fr=2×104～106超速离心机第10页，课件共61页，创作于2023年2月离心分离法根据其操作方式的不同，又可分为差速离心和密度梯度离心。1)差速离心法如果所要的蛋白质(或生物大分子)主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等；则可利用差速离心（differentialcentrifugation）方法将它们分开收集，该细胞组分作为下步纯化的材料。第11页，课件共61页，创作于2023年2月优点：可以一下子除去很多杂蛋白质，使纯化工作容易得多。如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。第12页，课件共61页，创作于2023年2月差速离心法的原理差速离心是利用不同离心速度产生不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分别分开。不同物质有不同的形状、大小、质量和密度，当在介质中离心时，它们的沉降速度各有差异。第13页，课件共61页，创作于2023年2月大的颗粒碎片在低速时很快沉降，被分离的物质留在上清液中;逐步增加离心力，进一步离心上清液，使中等颗粒沉降，最后是大小和密度最小的颗粒沉降。注意：每次得到的沉淀，必须经过几次洗涤后，反复悬浮和离心，才能得到比较纯的部分。第14页，课件共61页，创作于2023年2月差速离心图示第15页，课件共61页，创作于2023年2月差速离心的方法为了将细胞中各种组分纯化分离，首先要在等渗缓冲液中把细胞破碎匀浆;然后用差速离心的方法，把匀浆液中的各种组分分离;在离心场中，不同大小的颗粒沉向离心管底部的速率不同。第16页，课件共61页，创作于2023年2月差速离心的方法当离心力低，离心时间短时，细胞核即可沉到管底；加大离心力后，又可分离出线粒体；离心力再加大，才能分离出微粒体和核糖体。最后几步的超离心力，可超过地心引力的10万倍以上，悬液经离心分离出核糖体以后所剩的上清液，则是由细胞原生质的可溶性部分和极微小的颗粒所组成，这些组分则需要更严格的离心方法才能分离出来第17页，课件共61页，创作于2023年2月2)一般密度梯度离心法也称分级区带离心，有：1）蔗糖密度梯度离心2）氯化铯密度梯度离心用于RNA-DNA混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离第18页，课件共61页，创作于2023年2月一般密度梯度离心法：把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续的分离区带。第19页，课件共61页，创作于2023年2月一般密度梯度离心图示第20页，课件共61页，创作于2023年2月3)等密度梯度离心法等密度梯度离心法：不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）并形成区带，此即等密度梯度离心法。第21页，课件共61页，创作于2023年2月等密度梯度离心法第22页，课件共61页，创作于2023年2月三、离心过滤 1）离心过滤的原理以离心力作为推动力完成过滤操作,具有离心和过滤的双重作用。2）影响离心过滤速度的因素过滤面积和离心力第23页，课件共61页，创作于2023年2月离心过滤机可分离固体密度大于或小于液体密度的悬浮液。可分为:连续式离心机和间歇式离心机。第24页，课件共61页，创作于2023年2月第二节细胞破碎细胞破碎：指选用物理，化学，酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。第25页，课件共61页，创作于2023年2月一、细胞壁结构细胞壁化学组成非常复杂,取决于微生物类型细胞的年龄细胞的生长生理学多糖，脂质，蛋白质在三维结构上的排列方式第26页，课件共61页，创作于2023年2月细胞壁的结构第27页，课件共61页，创作于2023年2月二、细胞破碎率破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。1）直接记数法2）间接记数法第28页，课件共61页，创作于2023年2月1）直接记数法平板计数技术需时长；只有活细胞才能计数；会产生误差血球细胞器上用显微镜计数快速而简单，但细胞小计数困难第29页，课件共61页，创作于2023年2月2）间接记数法在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量（如可溶性蛋白，酶等）。将破碎后的细胞悬液离心去掉固体（完整细胞和碎片），然后对上清液进行含量或活性分析。酶活性是破碎程度的很好指示参数。第30页，课件共61页，创作于2023年2月三、细胞破碎的方法破碎方法机械法非机械法固体剪切作用液体剪切作用珠磨法压榨法高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法第31页，课件共61页，创作于2023年2月1）珠磨法（图3-6）作用机理：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混匀，珠子之间及珠子与细胞之间相互剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。第32页，课件共61页，创作于2023年2月影响因素：①转盘转速：破碎比速度与转盘速度成正比。②细胞浓度：最佳浓度应由实验确定。浓度大，产生的热量大，但单位细胞重量所消耗的功率小。③珠粒大小：在一定范围内，磨珠越小，破碎速度越快，但也不能过小。第33页，课件共61页，创作于2023年2月④温度：将温度控制在5～40℃对破碎物影响较小。⑤流量：流量大，加工单位质量细胞消耗的能量减小，但细胞的破碎程度和蛋白质的释放量会降低。第34页，课件共61页，创作于2023年2月

温控与能耗珠磨机是采用夹套冷却的方式实现温度控制的，一般情况下能将温度控制在要求的范围内；珠磨机的能耗与细胞破碎率成正比；高的破碎率会提高分离的成本。第35页，课件共61页，创作于2023年2月2)高压匀浆法（图3-8）作用机理从高压室压出的细胞悬浮液，经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙中喷出，速度可达几百米每秒。这种高速喷出的悬液又射击到静止的碰撞环上，被迫改变方向从出口管流出。第36页，课件共61页，创作于2023年2月

温控与能耗活性物质在破碎过程中的失活问题。蛋白质和酶的失活主要由匀浆过程中产生的热引起。如果能将温度控制在35ºC以下，酶失活的损失可以忽略。提高压力有利于细胞破碎，但需增加能耗。机械破碎的能耗主要包括提供动力消耗的能量及低温操作消耗的能量。第37页，课件共61页，创作于2023年2月3)超声波法作用机理声频高于15～20KHz的超声波在高强度声能输入可以引起空化现象，使气泡形成、胀大和破碎的现象。第38页，课件共61页，创作于2023年2月此法多适用于微生物材料、细胞培养材料的破碎；因超声波处理时产热较多，故应用此法时，需要采取降温措施；另外，某些核酸及酶对超声波敏感，慎用此法。第39页，课件共61页，创作于2023年2月超声波破碎过程效率的影响因素：①声频②声能③处理时间④细胞浓度⑤菌种类型第40页，课件共61页，创作于2023年2月四)化学渗透法

用化学药品改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来，这种处理方式称为化学渗透法。作用机理化学渗透取决于化学试剂的类型及细胞壁和膜的结构与组成。不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。第41页，课件共61页，创作于2023年2月有机溶剂（苯、甲苯）表面活性剂有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）表面活性剂处理法使细胞膜破坏。金属螯合剂（EDTA）变性剂（盐酸胍、脲）第42页，课件共61页，创作于2023年2月五)酶溶法

用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。溶菌酶、ß-1，3-葡聚糖酶、ß-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶等。第43页，课件共61页，创作于2023年2月作用机理溶酶具有高度专一性，蛋白酶只能水解蛋白质，葡聚糖酶只能水解葡聚糖，因此，利用溶酶系统处理细胞必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的使用次序。第44页，课件共61页，创作于2023年2月酶溶法的优点：①产品释放的选择性高②抽提的速率和收率高③产品的破坏最少④对pH和温度等外界条件要求低⑤不残留细胞碎片第45页，课件共61页，创作于2023年2月六)物理法①渗透压冲击法②反复冻融法多用于动物细胞。将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。③低温玻璃化法指从超微结构上损伤细胞，使细胞壁、细胞膜等成分遭受破坏。第46页，课件共61页，创作于2023年2月各种破碎方法的比较及选择分类具体方法优缺点及适用范围机械破碎法珠磨法破碎率高，适用范围广，但后处理复杂高压均浆法破碎率高，可大规模操作，适用范围小超声波破碎适用于实验室小规模操作物理破碎法冻融法操作简便，但不适用于对冷冻敏感的细胞低温玻璃化成本高，适用于实验室小规模生产化学渗透法加入特定化学试剂选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但作用时间长，适用范围小酶溶法加入酶选择性高，细胞碎片大，后处理容易；但成本高，适用范围小第47页，课件共61页，创作于2023年2月细胞破碎技术的发展方向①多种破碎方法相结合②与下游过程相结合破碎过程要易于细胞碎片的除净。③与上游过程相结合培养基、生长期、操作参数等。第48页，课件共61页，创作于2023年2月第三节胞内产物的溶解及复性一、包含体及其形成二、包含体的分离和溶解三、蛋白质复性第49页，课件共61页，创作于2023年2月（一）包含体及其形成

1)包含体的概念在基因工程菌细胞内表达的重组蛋白，常常互相交联在一起，形成不溶性的聚积物，通常称为包含体。第50页，课件共61页，创作于2023年2月包含体在相差显微镜下呈现为许多个高度折光的颗粒，含有这些包含体的大肠杆菌的菌体变大，并出现突起部分。在电镜下，包含体是无明显的膜存在，大致为圆形，直径可达1微米。包含体第51页，课件共61页，创作于2023年2月包涵体存在于包含体内的重组蛋白通常无生物活性，其形成与否取决于蛋白质的类型。含有二硫键的真核生物蛋白质，在原核生物中进行表达，常常因重组蛋白内及分子间二硫键的错配，而产生无活性的蛋白质，成为不溶性的物质。第52页，课件共61页，创作于2023年2月包含体形成的原因①产生少量蛋白时，可溶，量过多时，在细胞内超过其溶解度而沉淀；②蛋白质合成速度太快，肽链来不及形成正常的折叠构象，导致分子间因疏水作用聚合而不溶，生物活性受影响；第53页，课件共61页，创作于2023年2月③高表达的蛋白没有形成正常的二硫键，或宿主细胞内氧化还原等条件不同而生成不同的-S-S-；④蛋白的溶解需要与其他成分结合或经其他成分诱导形成适当的可溶性构象，当产生的蛋白量过多，所需其他成分相对不足，如折叠酶，分子伴侣等。第54页，课件共61页，创作于2023年2月⑤包含体的形成亦与蛋白质自身稳定性有关。第55页，课件共61页，创作于2023年2月二、包含体的分离