泛素化蛋白质组

一、叶片总蛋白的提取消化1、取2g叶片，在研钵中加入液氮充分研磨，然后转到离心管中，加入30ml预冷的含有10%TCA和0.07%DTT的丙酮，充分混匀后在-20°C沉淀过夜。2、4°C，35000g离心1h后，弃上清。加入30ml预冷的含有0.07%DTT的丙酮，充分混匀后置于-20°C中1h。4°C，35000g离心1h，弃上清。3、用30ml预冷的含有0.07%DTT的丙酮洗涤沉淀2次，最后打开管盖风干，尽量使残留的丙酮挥发干净。4、取适量裂解液(20MmHEPESpH8.0，8MUrea，2.5mM焦磷酸钠，1mMβ-甘油磷酸盐，50uMPR-169)溶解蛋白粉末。5、25000g，4°C离心30min后，收集上清，即为蛋白，如上清含有杂质可再离心一次，定量测定蛋白含量后置于-80°C或进行下一步操作。本实验采用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质浓度，用BSA作为标准液，在96孔板中加入相应的BSA标准蛋白以及考马斯亮蓝试剂。BSA浓度（ul）0.20.40.60.81.01.21.41.62.02.43.0100μg/ml标准蛋白(μl)0.81.62.43.244.85.66.48.09.612H2O(μl)39.238.437.636.836.035.234.433.632.030.428.0按顺序将上述标准蛋白加入96孔板，同时，将5μl待测蛋白液，95μl的考马斯亮蓝试剂混匀后加入96孔板，三次重复，避光静置5-10min后，置于分光光度计下测定在595nm处的吸光度，取595nm处吸光值与对应标准蛋白浓度制作标准曲线，并计算待测样品的浓度。6.加1/278体积（36ul/10ml蛋白提取物）的1.25MDTT至蛋白上清液，混合均匀，置于55℃30min；7.冰浴使温度恢复至室温（不能太冰会沉淀）；8.加1/10体积（1ml）碘乙酰胺溶液，混匀，室温避光15min；9.用20mMHEPESPH8.0稀释蛋白液1:4倍（30ml/10ml蛋白提取物），至尿素终浓度至2M；10.加1/100体积（100ul）的1mg/mltrypsin-TPCK，室温过夜（37℃培养箱14-18h）；二、裂解肽段的纯化1.在样品中加1/20体积（2ml）的20%TFA至终浓度为1%进行酸化，用pH试纸条测pH<3。冰浴15min，生成沉淀；2.室温5000g离心15min，取上清至新的50ml离心管；3.把10ml的注射器安装到Sep-Pak柱的短端，5ml100%乙腈预湿；4.用1ml，3ml，6mlSolventA（0.1%TFA）依次过柱清洗；5.加入酸化的酶解产物（样品）；6.用1ml，3ml，6mlSolventA（0.1%TFA）依次过柱清洗；7.再用2mlSolventC（5%乙腈，0.1%TFA）过柱清洗；6.把柱子置于新的10ml塑料管上收集洗脱液。用3x2mlofSolventB(0.1%TFA,40%乙腈)依次洗脱肽段（用2ml管装洗脱液，每管1ml，易冻干）。7.-80℃冷冻洗脱液2h（或过夜），置于真空干燥机，冻干以除尽TFA。（Note:在冻干前后消化的肽段都可以在-80℃保存数月，但加了IAPbuffer以后就要继续做下去）三、免疫亲和纯化（IAP）1.冻干的肽段2000g（rcf），5min离心后（使粉末都在管底）加入1.4ml预冷的1xIAP缓冲液，用1ml的移液枪吸打重悬（避免气泡），用pH试纸测pH为中性（不低于6）后（若小于6，则用未调节pH的1MTris碱溶液滴定，5-10ul通常足以中和溶液），转移到2ml离心管中；2.10,000g，4℃，离心肽段5min，去掉不溶物，置于冰上；3.柱子先2000g离心30sec，去掉缓冲液，再用1mL1XPBS清洗motifantibody-bead4次，每次洗涤后2000g离心30sec，最后用40ulPBS重悬；4.加肽段到含motifantibody-bead的2ml离心管中，充分混匀，避免气泡；5.用parafilm密封离心管，4℃转动孵育2h；6.2,000g，4℃，离心1min，保存上清（因为上清中含有未结合的肽段），用1ml移液枪转移上清至2ml管中，-80℃备用。（Note:以下清洗过程都需在0-4℃进行）7.用1ml预冷的IAPbuffer清洗beads，颠倒混匀5次，2000g离心30s，用1ml移液枪弃上清，重复一次；8.用预冷的ddH2O清洗beads，颠倒混匀5次，2000g离心30s，弃上清，重复2次，最后一次清洗要震荡充分混匀，最后离心5s，用200ul的移液器去除管壁上的液体；9.在beads中加入55µl0.15%TFA，拍打管底混匀，不能涡旋，室温静置10min（每2-3min温和混匀一次），此时肽存在于洗脱液中；10.2,000g离心1min，转移上清至新2ml离心管中；11.重复上述步骤1次，把2次洗脱液都收集到同一个管中，再次简单离心沉淀beads，转移洗脱液到新的管中，再平均分为2份。四、泛素化修饰肽段的浓缩与纯化A:缓冲液准备（HPLC水）（有机溶剂易挥发，含小量的溶液建议现配现用）1．SolventD：（0.1%TFA；50%乙腈）加0.1mlTFA至40mlddH2O中，然后加50ml乙腈，用水补齐至100ml。2.SolventA:（0.1%TFA）加0.1毫升TFA至50毫升水中，用水补齐至100毫升3.SolventB：（0.1%TFA;40%乙腈）0.1毫升TFA到30毫升水中，然后加40毫升乙腈，水补齐至100毫升B：流程1.用100%乙腈平衡StageTip1次（每次吹打10-20下，下同）；2.用100ulSolventD平衡StageTip1次，然后用100ulSolventA平衡StageTip1次；3.分2次加50ul的IP产物过StageTip柱；4.用100ul的SolventA洗柱子1次；5.用20ul的SolventB洗脱1次，并收集；6.最后将洗脱液收集在一管中-80℃放置2h，真空抽干，并用用于LC-MC分析的溶剂溶解（如SolventC:5%乙腈，0.1%TFA）。即：.100ul100%乙腈，吹打10-20次.100ul0.1%TFA；50%乙腈，吹打10-20次.100ul0.1%TFA，吹打10-20次④．样品，吹打10-20次⑤．100ul0.1%TFA，吹打10-20次⑥．20ul0.1%TFA；40%乙腈，吹打10-20次2.2.5LC-MS/MS质谱鉴定质谱设置参数如下：浓缩纯化后的肽段用ThermoScientificLTQ-OrbitrapVelos质谱仪进行分析，质谱扫描分辨率为60000（350−2000m/z）。经过CID（collision-induceddissociation）碰撞裂解的离子碎片由Orbitrap分析器捕获，碰撞能量为27eV。采用Agilent(75μmID,150mmlength)分析柱装填，流动相包括溶液A（0.1%甲酸）和溶液B（100%乙腈和0.1%甲酸）。用UltiMate3000RSLCnanoUHPLCsystem（DionexCorpo