2基因工程的主要技术原理

GeneticEngineering第二章基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理第二章基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。第一节DNA的提取与纯化2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理大肠杆菌基因组DNA2基因工程的主要技术原理一、质粒DNA的提取2基因工程的主要技术原理plasmidDNAThegenomicDNAofE.coli:asinglecirculardouble-strandedDNA,withthecontourlengthabout850timeslongerthanthecell.

GenomicDNA2基因工程的主要技术原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；（1）原理1.碱抽提法提取质粒DNADNA双链变性DNA单链复性强碱中性2基因工程的主要技术原理染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。变性2基因工程的主要技术原理（2）所用的试剂作用①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。（2）所用的试剂作用①溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH>8）下有活性。②葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。2基因工程的主要技术原理③EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。④NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH>12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS:

溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白—SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。2基因工程的主要技术原理冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。用于沉淀DNA。⑥乙醇DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。⑤NaAc-HAc缓冲液2基因工程的主要技术原理⑦RNaseA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。⑧TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。2基因工程的主要技术原理蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。⑨酚-氯仿选用以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。2基因工程的主要技术原理（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤SolutionI的配制：使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁。第一步：溶菌50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNaseA2基因工程的主要技术原理溶液II

破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性SolutionII的配制：第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。SolutionIII的配制：0.2NNaOH，1.0%SDS3M醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）2基因工程的主要技术原理上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。第五步：纯化DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA2基因工程的主要技术原理最重要的是：2.影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。（1）受体菌株endA基因编码核酸内切酶Ⅰ，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。2基因工程的主要技术原理这是直接决定DNA产量的重要因素之一。（3）质粒大小分子量大的质粒，拷贝数少。（2）质粒拷贝数质粒本身的性质所决定。2基因工程的主要技术原理若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量g/mlpGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.12若干常用质粒的理论产量质粒名分子大小bp拷贝数质粒产量g/mlpGEMpUCpBR322ColE1pACYCpSC101270027004400450040009000300-700500-700>25>15≈10≈61.8-4.12.9-4.1>0.32>0.15≈0.09≈0.122基因工程的主要技术原理二、基因组或其他DNA的提取

一般过程及原理：1.细菌基因组DNA的制备（1）细胞裂解10%SDS和蛋白酶K。37oC温育。不用NaOH!2基因工程的主要技术原理（3）沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇。（2）DNA纯化CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。2基因工程的主要技术原理

一般过程及原理：动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。（1）组织粉碎2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提2基因工程的主要技术原理0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50oC温育。（2）细胞裂解（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。（5）除去RNA污染用RNase。用2倍体积的无水乙醇。（4）沉淀DNA（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）2基因工程的主要技术原理

一般过程及原理：（1）组织粉碎用液氮冷冻后研磨成细粉末。3.从植物组织中制备DNA（2）细胞裂解用2%CTAB/2-ME(十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。或1%SDS和蛋白酶K。65oC温育。2基因工程的主要技术原理用0.6倍体积的异丙醇（-20oC）。（3）纯化DNA用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。（4）沉淀DNA（5）除去RNA污染用RNaseA。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）。2基因工程的主要技术原理三、DNA的定量和纯度测定1.紫外光谱法DNA（或RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。原理：蛋白质在280nm处有吸收峰2基因工程的主要技术原理222基因工程的主要技术原理溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发红色荧光。2.琼脂糖凝胶电泳估计原理：与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。2基因工程的主要技术原理一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如DNA的HindⅢ酶切物等。四、DNA分子量的估计MarkerMarker2基因工程的主要技术原理DNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarkerDNAladder28kb2500bp2300bp1300bp900bp750bp200bp5000bp20kb1000bp900bp800bp700bp600bp500bp400bp300bp200bp100bpDNAMarker2基因工程的主要技术原理C

TranscriptlevelsofriceKNOXgenesOSH1andOSH3revealedbyRT-PCRinleavesfromwild-type(WT),phenotypicYAB3RNAi(Y1andY2),andWOX3overexpressionplants(W1andW2).ShootapexmRNAwasusedasapositivecontrol(S).2基因工程的主要技术原理1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。2.电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。3.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。一、电泳的基本原理第二节DNA的凝胶电泳2基因工程的主要技术原理4.如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关:分子量越大，移动越慢。摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。5.2基因工程的主要技术原理Relaxed

supercoiled

Increasingdegreeofsupercoiling

相同分子量的DNA:闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理Agarosegelelectrophoresis

Gelelectrophoresisisnotonlyusedasananalyticalmethod,itisroutinelyusedpreparativelyforthepurificationofspecificDNAfragments.Thegeliscomposedof:

Agarose:forDNAfragmentsranginginsizefromafewhundredbasepairstoabout20kb(Fig.2.1).

Polyacrylamide:forsmallerDNAfragments.2基因工程的主要技术原理Fig.2.1ElectrophoresisofDNAinagarosegels.DNAbandshavebeenvisualizedbysoakingthegelinasolutionofethidiumbromide(seeFig.2.2),whichcomplexeswithDNAbyintercalatingbetweenstackedbase-pairs,andphotographingtheorangefluorescence.2基因工程的主要技术原理Fig.2.2Ethidiumbromide.

2基因工程的主要技术原理Agarosegelisacomplexnetworkofpolymericmoleculeswhoseaverageporesizedependsonthebuffercompositionandthetypeandconcentrationofagaroseused.2基因工程的主要技术原理Inanyevent,gelelectrophoresisisfrequently

performedwithmarkerDNAfragmentsofknown

size,whichallowaccuratesizedeterminationofan

unknownDNAmoleculebyinterpolation(插入).

InadditiontoresolvingDNAfragmentsofdifferentlengths,gelelectrophoresiscanbeusedtoseparatedifferentmolecularconfigurationsofaDNAmolecule.2基因工程的主要技术原理Gelelectrophoresiscanalsobeusedforinvestigatingprotein–nucleicacidinteractions,basedontheobservationthatbindingofaproteintoDNAfragmentsusuallyleadstoamobilityreduction.2基因工程的主要技术原理二、琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖2.琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高空隙小2基因工程的主要技术原理琼脂糖的浓度（%）分离DNA的片断大小（bp）0.30.71.450000—100020000—10006000—300空隙小，分辨率高：小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。3.琼脂糖凝胶的分辨力空隙大小决定其分辨分子大小的能力。2基因工程的主要技术原理

1、概述：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳2基因工程的主要技术原理优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离DNA片断大小（bp）4.010.020.01000—100500—2550—1三、聚丙烯酰胺凝胶电泳其优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。聚丙烯酰胺凝胶浓度（%）分离DNA片断大小（bp）4.010.020.01000—100500—2550—1琼脂糖凝胶电泳：1000——50000bp聚丙烯酰胺凝胶电泳：1——1000bp2基因工程的主要技术原理2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理与装置（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。电泳buffer电泳buffer2基因工程的主要技术原理电泳方向2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。商品化供应Da道尔顿(质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。一克约为6×1023道尔顿3、蛋白质电泳的分子量标准2基因工程的主要技术原理DaltonSDSPAGE2基因工程的主要技术原理4、凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可褪色回收。硝酸银：灵敏度高、可检出2-5ng/带。2）转到膜上进行染色。1）直接染色2基因工程的主要技术原理直接染色电泳结果2基因工程的主要技术原理四、凝胶染色1.染料溴化乙锭。Ethidiumbromide（EB）2基因工程的主要技术原理EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。2.原理2基因工程的主要技术原理

2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理UVP全自动凝胶成像分析系统2基因工程的主要技术原理OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统2基因工程的主要技术原理

核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交（Southernblothybridization）和RNA印迹杂交（Northernblothybridization）。第三节核酸的分子杂交

2基因工程的主要技术原理DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。2基因工程的主要技术原理

Southern杂交的基本原理是将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

一、Southernblot2基因工程的主要技术原理Southernblot用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理Southernblot筛选结果2基因工程的主要技术原理二、Northernblot用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。

在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。其用途是检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。主要检测插入片断是否被转录。2基因工程的主要技术原理

蛋白质印迹(westernblot)，又称免疫印迹(immunoblotting)是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

WesternBlot基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况。WesternBlot采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。三、WesternBlot＃2基因工程的主要技术原理Westernblotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。①Western（转膜）胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。膜胶蛋白2基因工程的主要技术原理②Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。③Blotting过程ImmunoBlotting2基因工程的主要技术原理④结果多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结果2基因工程的主要技术原理四、原位杂交对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。需要目的基因的探针。2基因工程的主要技术原理32基因工程的主要技术原理第四节基因扩增技术PCR一、基因扩增（geneamplification)指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：1.环境诱发扩增2.基因的程序性扩增5.PCR扩增3.基因组进化扩增4.基因工程扩增2基因工程的主要技术原理1.环境诱发扩增如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。2.基因的程序性扩增如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。2基因工程的主要技术原理生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。5.PCR扩增应用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。3.基因组进化扩增4.基因工程扩增载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。2基因工程的主要技术原理（1）1.PCR的发明二、PCR技术（2）Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。1985年Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。PolymeraseChainReaction2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理（3）TaqDNA聚合酶1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中。使PCR自动循环仪成为可能。（4）PCR仪1988年Cetus公司发明自动热循环仪。1986年H.A.Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理PCR仪2基因工程的主要技术原理2.PCR技术的原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸2基因工程的主要技术原理双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’3’3’5’5’3’TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板变性模板模板（template）95oC2基因工程的主要技术原理TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。（2）DNA模板与引物复性模板模板ATCTTGAAC5’3’ACGTACGTA5’3’引物引物引物（primer）:40-65oC2基因工程的主要技术原理DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板模板ATCTTGAAC5’ACGTACGTA5’TaqTaq72oC2基因工程的主要技术原理理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。变性—复性—延伸。（5）1个循环的结果（4）新一轮循环开始DNAelongation2基因工程的主要技术原理3.PCR的过程（1）第一步变性（denature）94-95oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步复性（anneal）50-60oC下1分钟，引物优先与模板复性。①引物的浓度高，②引物的链短。2基因工程的主要技术原理94oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（4）第四步变性（denature）72oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第三步延伸（extend）（5）第五步重复（repeat）2基因工程的主要技术原理第二步——第三步——第四步复性延伸变性95oC5min50oC1min72oC2min94oC1min温度循环2基因工程的主要技术原理PCR仪的温度循环程序2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理PCR2基因工程的主要技术原理需要的模板量极低。4.PCR的特点（1）特异性强①PCR使用专门合成的DNA引物。②延伸过程是在高温下进行。（2）敏感性高这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！2基因工程的主要技术原理RT-PCR：对模板的纯度要求低。（5）可以扩增mRNA（4）简便先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。（3）快速整个PCR过程约4小时即可完成。不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。2基因工程的主要技术原理自从H.A.Erilish分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。（1）TaqDNA聚合酶5.影响PCR的因素TaqDNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。①热稳定性2基因工程的主要技术原理最适温度：75-80oC

延伸速度：约35-150nt/s.酶分子最长延伸长度：6.7kb②最适温度高③Taq酶的功能缺点具有5’3’聚合酶活性和5’3’外切酶活性，但没有3‘5’外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对！

合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。2基因工程的主要技术原理金属离子敏感（尤其是Mg2+

）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。4金属离子敏感（尤其是Mg2+

）。当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。④TaqDNA聚合酶的激活剂50mmol/LKCl也能激活TaqDNA聚合酶的活性。42基因工程的主要技术原理（2）其它耐热的DNA聚合酶①TthDNA聚合酶无3’5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。②VENTDNA聚合酶有3‘5’外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100oC高温。2基因工程的主要技术原理③PfuDNAPolymerase④

TaqPlusDNAPolymerase有3’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。但PCR产物为平端！是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的。是Taq和PfuDNA聚合酶的混合物。Taq的PCR产物3’端往往带有一个A。2基因工程的主要技术原理与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA。（3）引物（primer)①位置3’3’2基因工程的主要技术原理即2.751011bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。②引物的长度理论计算：419=2.751011。一般引物设计为长15—30bp。2基因工程的主要技术原理③引物的碱基序列

5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’3’GCTAGCTACTTAAG5’3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。templateprimer2基因工程的主要技术原理尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力;④引物的碱基组成避免连续相同碱基排列或内部回文序列。5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’CTGCCAGTCTAC3’GACGG5’T发卡结构1）2）2基因工程的主要技术原理3）避免形成引物二聚体（dimer）。

两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’3’CAGGACTTAGTCACT5’primer1primer2UpstreamprimervsDownstreamprimerSenseprimervsAntisenseprimerPrimer1vsPrimer2ForwardprimervsReverseprimer2基因工程的主要技术原理⑤引物的Tm值Tm=（G+C)4+(A+T)2当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55oC。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。实际复性温度选择低于Tm值5oC。手工计算：一般估计：2基因工程的主要技术原理⑥引物的浓度一般使用终浓度各0.5mol/L。⑦简并引物

如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。2基因工程的主要技术原理设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。引物设计现在多用专业软件

⑧套嵌引物（nestedprimers)1324如Primer5.0等2基因工程的主要技术原理Primer5.02基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。（4）模板（template)②模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。①纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。2基因工程的主要技术原理dNTPs是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。（5）dNTPs一般反应体系中dNTPs混合液终浓度用0.2mmol/L。浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率。2基因工程的主要技术原理TaqDNA聚合酶要求有游离的Mg2+

。（6）Mg2+

的浓度所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。2基因工程的主要技术原理借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。6.PCR技术的扩展（1）荧光实时定量PCRReal—time

PCR（或TaqMan

PCR）Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。

2基因工程的主要技术原理扩增两个引物外侧的未知序列（2）反向PCR把线性DNA模板转变成环形分子。templatetemplate3’5’5’3’（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。技术关键：2基因工程的主要技术原理使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。2基因工程的主要技术原理低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。（3）不对称PCR3’5’5’3’引物少用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。技术关键：两个引物的浓度相差100倍。2基因工程的主要技术原理扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。（4）反转录PCR（RT-PCR)Temin,H.发现反转录酶，1975诺贝尔奖技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。2基因工程的主要技术原理RNAtemplate3’5’下游引物cDNAfirststrand3’5’上游引物cDNAfirststrandcDNAsecondstrand3’5’3’5’反转录酶Taq酶PCRReversetranscription(RT)下游引物上游引物Taq酶2基因工程的主要技术原理Fig.3.RT-PCRanalysisofGbd1andGbd2inPima90followinginfectionbyV.dahliaeafter0,2,4,8,12,24,48,72and96h,respectively.M:100bpDNAladder.his-3ofcottonasthecontrol.2基因工程的主要技术原理7.PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA从基因组中扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；微量残留DNA扩增；分析模板序列；2基因工程的主要技术原理在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。（2）基因的体外诱变技术关键：利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。（2）基因的体外诱变技术关键：利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。（2）基因的体外诱变技术关键：利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。2基因工程的主要技术原理设计引物定点诱变2基因工程的主要技术原理利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。（3）基因组的比较研究比较不同物种之间的基因组特征和相似性。类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。RAPD(RandomamplifiedpolymorphismDNA)2基因工程的主要技术原理1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离开的技术。当时的分析思路局限于RNA序列分析法。第五节DNA序列分析（1965年Cornell大学的S.W.Holley等首次测定了75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片断法）。52基因工程的主要技术原理Sanger等1977年发明。一、双脱氧链终止法FrederickSanger,1980年NobelPrize化学奖2基因工程的主要技术原理（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。（2）脱氧核糖的连接是以3’5’磷酸二脂键。（3）复制反应可以在体外进行。（4）2’和3’双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。1.原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理（1）制备单链DNA模板2.技术要点就是待测序的DNA链。①不能有5’3’和3’5’的外切酶活性；②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。（3）特殊的DNA多聚酶dNTP/ddNTP=100/1

（4）制备2’和3’双脱氧的ddNTP时,DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。2基因工程的主要技术原理需带有放射性或荧光标记。（2）制备一小段单链引物（DNA或RNA）2基因工程的主要技术原理3.Sanger双脱氧终止法测序过程2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理模板序列2基因工程的主要技术原理1977年，哈佛大学的A.M.Maxam和W.Gilbert发明。二、Maxam-Gilbert化学修饰法WalterGilbert,1980年NobelPrize化学奖2基因工程的主要技术原理末端放射性标记的DNA片单链长度只差一个核苷酸的DNA链混合物化学试剂处理凝胶电泳放射性自显影阅读碱基顺序特定的碱基中引入化学基团DNA在被修饰的核苷酸位置断裂1.原理2基因工程的主要技术原理碱基特异修饰方法GpH8.0,用硫酸二甲脂对N7进行甲基化，使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0,哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化，从而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易于除去C在1.5mol/LNaCl存在时，可用肼除去胞嘧啶2.碱基特异的化学修饰法2基因工程的主要技术原理反应切割碱基修饰修饰碱基的转移DNA链的断裂R1G>A硫酸二甲脂pH7.0加热氢氧化钠R2A>G硫酸二甲脂酸氢氧化钠R3C+T肼六氢吡啶六氢吡啶R4C肼+盐六氢吡啶六氢吡啶R5G硫酸二甲脂六氢吡啶六氢吡啶R6G+A酸酸六氢吡啶R7C+T肼六氢吡啶六氢吡啶R8C肼+盐六氢吡啶六氢吡啶R9A>C氢氧化钠六氢吡啶六氢吡啶R10G>A硫酸二甲脂pH7.0加热六氢吡啶R11G亚甲蓝六氢吡啶六氢吡啶R12T四氧化锇六氢吡啶六氢吡啶3.碱基特异的化学切割法2基因工程的主要技术原理4.测序过程2基因工程的主要技术原理每组反应只针对特定的碱基，共有4组反应，可分别显示G、A+G、C、C+T的终止位置。特点：读出的序列就是要测的序列。Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理测序读片2基因工程的主要技术原理90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。1.原理（1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形成完全的双链分子。杂交效率最高。三、DNA杂交测序（2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。（3）非互补碱基越多，杂交效率越差。2基因工程的主要技术原理（4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的碱基排列序列作探针。8mer探针有48=65536种序列。如：8-mer靶DNA同65536中的一种探针完全杂交形成完全互补双链。（5）根据杂交效率可推断出靶DNA的序列。5’-AGCCTAGC-3’Target3’-TCGGATCG-5’Probe假如探针序列已知，则可推知靶DNA序列。2基因工程的主要技术原理但：12mer靶DNA与8-mer探针杂交，将会有5种探针与之形成完全互补双链。3’-TCGGATCG-5’3’-CGGATCGA-5’3’-GGATCGAC-5’3’-GATCGACT-5’3’-ATCGACTT-5’5’-AGCCTAGCTGAA-3’12-mertarget8-merprobe假如知道能与之完全杂交的所有5种探针序列，就可推知12bp的靶DNA序列。2基因工程的主要技术原理（1）DNA芯片（chip）把寡聚核苷酸探针的3‘端或5’端与玻璃或凝胶形成共价连接。目前可以做出65536种8-mer探针芯片。2.技术要点每种探针的序列和位置已知，可被电脑读出。2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理DNAchip杂交2基因工程的主要技术原理（1）非放射性标记1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。四、DNA自动化测序荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。1.技术要点（2）不同的标记对象既可标记引物，也可标记ddNTP。2基因工程的主要技术原理（4）分析自动化（3）读片的自动化激光探头直接读胶，实时阅读。（2）反应的自动化Sanger脱氧终止法。电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。（5）反应可在一个试管中进行标记ddNTP时。2基因工程的主要技术原理2.荧光标记引物的自动化测序①分别用4种荧光物标记引物，②区分反应产物，③混合电泳，④激光一次读胶，⑤电脑合成结果。2基因工程的主要技术原理2基因工程的主要技术原理3.荧光标记ddNTP自动测序原理图解4种不同的荧光物分别标记4种ddNTP。2基因工程的主要技术原理可在同一管中进行2基因工程的主要技术原理可在单一泳道电泳。2基因工程的主要技术原理荧光标记终止法测序2基因工程的主要技术原理测序结果2基因工程的主要技术原理毛细管测序仪日本开发的世界上最高速DNA测序仪。可同时解析384个样品！标记法：4色荧光、引物标记/终端标记。测序长度：600bp/毛细管6毛细管测序仪日本开发的世界上最高速DNA测序仪。可同时解析384个样品！标记法：4色荧光、引物标记/终端标记。测序长度：600bp/毛细管62基因工程的主要技术原理第六节酵母双杂交系统YeastTwoHybridSystem(Interactiontrap)90年代，纽约大学的S.Field等建立。2基因工程的主要技术原理ConstructedthreesetoftestrecombinationPlasmidsintoyeast(双因子杂交系统)GAL4activationdomainLexDNA-bindingdomainGAL1operatorLacZasreporterUASGGAL1operatorLacZasreporterGAL1operatorLacZasreporterLexAenhancer1、双因子杂交试验：2基因工程的主要技术原理GAL1operatorLacZasreporterUASGGAL1operatorLacZasreporterGAL1operatorLacZasreporterLexAΒ-galactosidase1800unitsNothing520unitsGAL4GAL4-LexAGAL4+UASenhanciingGAL1LacZNoactivatornoLacZexpressingLexA+LexA.GAL4activation

GAL1LacZexpressingenhancer2基因工程的主要技术原理Transcription-activatingandDNA-bindingdomainofGAL4canoperatequiteindependentlyFunctionofactivationdomain

recruitmenttheRNApolymerasetopromoterGAL1operatorLacZasreporterLexA