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分子生物学

——从一个表达系统说起西北农林科技大学许晓东(2017.02)DNA双螺旋模型的建立、密码子的发现和解读，使传统生物学上差异巨大的动物、植物和微生物在分子水平上统一在了一起。这使生物学家有机会在一个物种中表达另一个物种的蛋白质。现在，我们试图建立一个能表达外源基因的大肠杆菌表达系统……中心法则我们需要宿主和载体Host:Escherichiacolivector:plasmid载体（vector）为什么需要一个载体？我们需要一个能在宿主内存活的载体。

转化现象质粒（plasmid）质粒：是染色体外能够自主复制的较小的DNA分子。大部分的质粒虽然都是环状构形，然而目前也发现有少数的质粒属于线性构形，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。质粒为什么能够自主复制？

因为质粒上有复制起始位点，是一个“复制子（replicon）”。质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringentcontrol)和松弛控制型(Relaxedcontrol)。现在需要一个位点用于插入外源基因片段——即多克隆位点（multiplecloningsite,MCS）。MCS是包含多个限制性酶切位点（restrictionsite）的一段很短的DNA序列。把要表达的外源基因连接到质粒上……这样可以吗？不行，我们需要启动子和终止子。

启动子（promotor）是一段能被RNA聚合酶所识别的序列。repliconForeigngenerepliconrepliconPlasmidpromoterterminator如何让mRNA被翻译机器识别？repliconForeigngenerepliconrepliconPlasmidpromoterE.colimRNAproteinXterminator需要核糖体结合位点（ribosomebindingsite）ATG……………promoterRBSribosomebindingsiteAUG……………DNAmRNAprotein现在的问题是：如何使表达受控。TimeOD600promoterDNAmRNAproteinpromoter野生型大肠杆菌带外源基因的大肠杆菌乳糖代谢酶基因的表达就是可控的——乳糖操纵子。初步构建了载体还是有一定量的基础表达。表达水平不高。IPTG降低基础表达：提高表达量：使用超强启动子T7phageT7RNApolymerase最终的表达系统BL21(DE3)LacI另一个解决方案BL21(DE3)LysSLines:marker(M),cellextractof

E.coliBL21(DE3)-pET22b(1);celllysateandextractof

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BL21(DE3)-pET22b-mocpA(2,3);of

E.coliBL21(DE3)-pET22b-mocpB(4,5);of

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BL21(DE3)-pET22b-mocpC(6,7);of

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