卫生化学紫外可见分光光度法优秀课件

卫生化学紫外可见分光光度法第1页，课件共94页，创作于2023年2月卫生化学第四章紫外-可见分光光度法2第2页，课件共94页，创作于2023年2月紫外-可见分光光度法（ultraviolet-visiblespectrophotometry,UV-Vis）是光谱分析法中一种重要的、广泛应用的分析方法。光谱分析法（spectroscopicanalysis）：是指利用物质与辐射能作用时所吸收或发射辐射的特征和强度而建立起来的定性、定量及结构分析方法。3第3页，课件共94页，创作于2023年2月如原子吸收分光光度法如原子发射光谱法如紫外-可见、红外如分子荧光分析法4第4页，课件共94页，创作于2023年2月紫外－可见分光光度法是根据物质分子对紫外或可见光区电磁辐射的吸收特征和吸收程度建立起来的分析方法．紫外区波长200～400nm

可见区波长400～760nm特点灵敏度、准确度高、操作简便快速、应用广泛5第5页，课件共94页，创作于2023年2月待测物质6第6页，课件共94页，创作于2023年2月第一节概述

一、电磁辐射和电磁波谱光属于电磁辐射，基本单位是光子，光子具有波粒二象性：波动性7第7页，课件共94页，创作于2023年2月光的传播速度：c－真空中光速2.99792458×108m/sn－折射率，真空中为1λ－波长，单位：m,cm,mm,µm,nm,Å（1Å=10-10m）γ－频率，单位：赫兹(周)Hz次/秒8第8页，课件共94页，创作于2023年2月光量子，具有能量：h－普朗克(Planck)常数6.626×10-34J·sγ－频率E－光量子具有的能量单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)1eV=1.602×10-19J微粒性9第9页，课件共94页，创作于2023年2月结论:一定波长的光具有一定的能量，波长越长(频率越低)，光量子的能量越低。单色光：具有相同能量(相同波长)的光。混合光：具有不同能量(不同波长)的光复合在一起.例如白光。波粒二象性10第10页，课件共94页，创作于2023年2月高能辐射区γ射线能量最高，来源于核能级跃迁

χ射线来自内层电子能级的跃迁光学光谱区紫外光来自原子和分子外层电子能级的跃迁可见光红外光来自分子振动和转动能级的跃迁波谱区微波来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波来自原子核自旋能级的跃迁γ射线→X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波波长长电磁辐射按波长顺序排列称为电磁波谱。第11页，课件共94页，创作于2023年2月12第12页，课件共94页，创作于2023年2月第二节基本原理1.紫外-可见吸收光谱的形成当光通过气态、液态或固态的物质时，物质分子选择性吸收辐射，产生紫外-可见吸收光谱，又称为分子吸收光谱。

13第13页，课件共94页，创作于2023年2月物质分子内部三种运动状态对应三种能级：电子绕核运动（电子跃迁）→电子能级△E电原子在平衡位置上振动→振动能级△E振

分子绕轴转动（分子转动）→转动能级△E转

14第14页，课件共94页，创作于2023年2月电子基态电子激发态J3J2J1J3J2J1J3J2J1J3J2J1J3J2J1J3J2J115第15页，课件共94页，创作于2023年2月物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，物质也只能选择性地吸收那些能量相当于该分子振动能变化△Ev、转动能变化△Er以及电子运动能量变化△Ee的总和△E的辐射。由于各种物质分子内部结构的不同，分子的各种能级之间的间隔也互不相同，这样就决定了物质对不同波长光线的选择性吸收。16第16页，课件共94页，创作于2023年2月有色物质的不同颜色是由于吸收了不同波长的光

（互补光）所致。第17页，课件共94页，创作于2023年2月2.分子吸收光谱及其特征将不同波长的单色光依次通过一定的溶液，分别测出对各种波长的光的吸收程度（用A表示）。以波长为横坐标，吸光程度为纵坐标作图，所得的曲线称为吸收曲线（absorptioncurve）或吸收光谱(absorptionspectrum)。18第18页，课件共94页，创作于2023年2月吸收光谱特征：定性依据吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→饱和σ-σ跃迁产生A19第19页，课件共94页，创作于2023年2月20第20页，课件共94页，创作于2023年2月（一）有机化合物的电子跃迁类型PxPyPzPxPyPzππ*σ*σn二、紫外－可见吸收光谱与分子结构的关系

21第21页，课件共94页，创作于2023年2月按能量大小：σ→σ*>

n→σ*>

π→π*>

n→π*22第22页，课件共94页，创作于2023年2月1.σ→σ*跃迁．饱和烃类（单键，且都是σ键）吸收光能后多发生此类跃迁，此跃迁所需能量大，（大约350kj/molσ键）一般吸收＜150nm的光，属于远紫外区（真空紫外区）

23第23页，课件共94页，创作于2023年2月２．n→σ*跃迁

含有杂原子（O、N、S、X）的饱和烃衍生物，这些杂原子上的n电子向着σ*跃迁。吸收波长在200nm左右．

24第24页，课件共94页，创作于2023年2月３．π→π*

此跃迁所需能量小（约200kj/mol键）．吸收波长为200nm左右．具有碳—碳双键（三键）的化合物会发生此类跃迁．孤立的π→π*跃迁．

吸收波长在160～190nm左右.如CH2=CH2λmax=165nmε=104共轭双键的π→π*跃迁．

由于π与π键之间相互作用形成离域键，使π→π*跃迁所需能量减小，而且共轭键越长所需能量越小．如丁二烯CH2=CH-CH=CH2λmax=217nm,ε=21000

25第25页，课件共94页，创作于2023年2月４．n→π*易发生在含有杂原子的不饱和基团中，如C=O、C=S、—N=N—等化合物。这些杂原子都有未成键的孤电子对．此类跃迁一般在近紫外区（200-400nm），但ε小，在10～100之间．26第26页，课件共94页，创作于2023年2月1．电荷迁移跃迁（亦称内ox—red过程）

所谓迁移跃迁是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向接受体相联系的轨道上跃迁，过程见下：NCH3CH3－+hvhvCRO+_吸收谱带较宽、吸收强度大、εmax≥104，是强吸收带。电子接受体电子接受体电子给予体电子给予体电子接受体电子给予体（二）无机化合物的电子跃迁类型27第27页，课件共94页，创作于2023年2月2．配位场跃迁四、五周期中的过渡金属元素分别有3d和4d轨道，镧系锕系分别含有4f和5f轨道，在配体存在下过渡元素五个能量相等的d轨道和镧、锕元素七个能量相等的f轨道分别分裂成几组能量不等的d轨道及f轨道.当它们吸收光能后，低能态的d电子或f电子可以分别跃迁到高能态的d轨道及f轨道上去。

一定要有配体的配位场作用.28第28页，课件共94页，创作于2023年2月29第29页，课件共94页，创作于2023年2月1．生色团（发色团）：能吸收紫外-可见光的基团

有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具n电子和π电子的基团产生n→π*跃迁和π→π*跃迁跃迁E较低例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—

注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强第30页，课件共94页，创作于2023年2月2．助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X第31页，课件共94页，创作于2023年2月5．红移和蓝移：由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后

吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）

吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）第32页，课件共94页，创作于2023年2月三、光的吸收定律

（一）Lambert-Beer定律一束单色光通过含吸光物质的溶液时Ia入射光I0透过光It反射光IrI0＝Ia+It+Ir≈Ia+It

由上式可知,I0不变，若

Ia↑则It↓,反之亦然33第33页，课件共94页，创作于2023年2月我们把：

It／I0=

T称作透光率（度）

T×100=T%称作百分透光率（度）T越大，表示溶液对光的吸收越少T越小，表示溶液对光的吸收越多常用吸光度来表示物质对光的吸收程度：34第34页，课件共94页，创作于2023年2月朗伯定律(1760年):

A=lg(I0/It)=k1b当入射光的λ,吸光物质的c一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比。比尔定律(1852年):A=lg(I0/It)=k2c当入射光的λ,液层厚度b一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比。35第35页，课件共94页，创作于2023年2月朗伯-比尔定律式中：A：吸光度；T:透射率；

b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；

c：溶液的浓度，单位mol·L-1或g·L-1；

K：吸光系数意义:当一束平行单色光通过均匀、非散射的溶液时，其吸光度与溶液中吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比.36第36页，课件共94页，创作于2023年2月值得注意的是：透过率T与c或b之间的关系是指数函数关系．吸光度A与c或b之间是简单的正比例关系．

1.00.50ACC100500T%T＝10–A=10-Kbc

A＝-lgT＝-lg(It/I0)=Kbc

37第37页，课件共94页，创作于2023年2月应明确定律的三个应用条件：1）稀溶液（C＜0.01mol/L)2）入射光为单色光3）均匀介质，可以为固体、液体和气体吸光度特性——加和性：A总=A1+A2+A3+A4…..38第38页，课件共94页，创作于2023年2月吸光系数（Absorptivity）

c---mol/Lε---摩尔吸光系数

L·mol–1·cm-1c--g/La---吸光系数

L·g–1·cm-1c--g/100mLE1%1cm---比吸光系数100mL·g–1·cm-1表示方法相互换算：39第39页，课件共94页，创作于2023年2月摩尔吸光系数ε

物理意义：当一定波长的单色光通过浓度为1mol/L，吸收池厚度为1cm的溶液时测得的吸光度。入射波长不同，ε不同溶剂不同，ε不同物质性质不同，ε不同ε可作为定性依据40第40页，课件共94页，创作于2023年2月在最大吸收波长λmax处，常以εmax表示。第41页，课件共94页，创作于2023年2月（二）偏离Beer定律的因素

偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面:1）光学因素2）与试样溶液有关的因素1.00.50AC正偏离负偏离42第42页，课件共94页，创作于2023年2月1.光学因素

1）非单色光的影响：非单色光指的是包含一定波长范围的有限宽度的谱带，是以λ０（中心吸收波长）为中心的一狭窄波长范围的复合光，对于带宽为△λ（即图中的Ｓ＝λ２－λ１）的单色光，测得的吸光度一般小于λ０处的真实吸光度值，从而产生负偏离。43第43页，课件共94页，创作于2023年2月2）杂散光的影响：

杂散光是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽度范围内，与所选波长相距较远。杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成。◆若样品不吸收IS

则（I0+Is）／（I+Is）＜I0／I，使A↓

◆若样品吸收IS，则反之，Ａ↑。44第44页，课件共94页，创作于2023年2月2.溶液的物理及化学因素的影响１）溶液浓度的影响Beer定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(C<10-2mol/L)时才基本符合。当溶液浓度C>10-2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。45第45页，课件共94页，创作于2023年2月２）体系（介质）不均匀的影响根据定律的应用条件之三（即均匀介质），一般真溶液质点小，对光的散射不特别厉害，但混浊液散射比较突出。胶体、乳胶、悬浮物、沉淀等非均相体系产生的光散射会引起对朗伯-比耳定律的偏离。解决的办法：用空白做对比。46第46页，课件共94页，创作于2023年2月第三节紫外-可见分光光度计

一、分光光度计的主要部件碘钨灯氘灯单色器参比池样品池光电倍增管数据处理和仪器控制光源样品池单色器检测器数据处理仪器控制47第47页，课件共94页，创作于2023年2月白炽光源：如钨丝灯、碘钨灯(可见光区，320～2500nm)气体放电光源：如氢弧灯（氢灯）、重氢灯（氘灯）(紫外区，180～375nm)、氙灯（紫外、可见光区均可用作光源）1.光源（辐射源）

48第48页，课件共94页，创作于2023年2月49第49页，课件共94页，创作于2023年2月２．单色器作用：将光源辐射的复合光按波的长短顺序色散为单色光包括狭缝、准直镜、色散元件1)狭缝入口狭缝：限制杂散光的进入出口狭缝：让色散后所需波长的光通过。2）准直镜（透镜或反射镜）把来自入口狭缝的发散光变成平行光把来自色散元件的平行光聚焦于出口狭缝。50第50页，课件共94页，创作于2023年2月3）色散元件常用的色散元件有三角棱镜和光栅棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同51第51页，课件共94页，创作于2023年2月光栅在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600，1200，2400条/mm)，利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光。优点：波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便52第52页，课件共94页，创作于2023年2月3．吸收池又名:比色皿，用于盛待测及参比溶液玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）53第53页，课件共94页，创作于2023年2月4．检测器作用：是检测通过溶液后的透过光强度

（光信号，并把光信号转变成电信号）１）光电管锑铯作阴极：紫敏（200～625nm)银／氧化银：红敏（625～1000nm)

90VDC直流放大阴极R-+光束e阳极丝（Ni）抽真空54第54页，课件共94页，创作于2023年2月２）光电倍增管（photomultipliertube,PMT）石英套光束栅极，Grill阳极屏蔽光电倍增管的放大倍数，主要取决于电极间的电压。55第55页，课件共94页，创作于2023年2月二、分光光度计的类型56第56页，课件共94页，创作于2023年2月１．单波长单光束分光光度计57第57页，课件共94页，创作于2023年2月特点：结构简单、价格低廉使用时来回拉动吸收池→移动误差比色池配对受光源、检测器的波动影响不能自动记录吸收光谱。58第58页，课件共94页，创作于2023年2月2．单波长双光束分光光度计59第59页，课件共94页，创作于2023年2月60第60页，课件共94页，创作于2023年2月特点：不用拉动吸收池，可以减小移动误差比切光器的频率慢的光源、检测器的波动不影响可以自动扫描吸收光谱61第61页，课件共94页，创作于2023年2月３．双波长分光光度计62第62页，课件共94页，创作于2023年2月特点：利用吸光度差值定量消除干扰和吸收池不匹配引起的误差比切光器的频率慢的光源、检测器的波动不影响63第63页，课件共94页，创作于2023年2月三种分光光度计的区别64第64页，课件共94页，创作于2023年2月第四节分析条件的选择一、溶剂选择1.考虑溶剂的截止波长截止波长：用1cm光径的吸收池装溶剂，用空气为参比，改变照射波长，当吸光度A＝l时，此时的波长称为该溶剂的截止波长。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长（截止波长）。第65页，课件共94页，创作于2023年2月662.考虑溶剂的极性溶剂的极性对物质的吸收峰位置的影响不同当极性增加时，π→π*的吸收峰发生长移（红移）n→π*的吸收峰发生短移（蓝移、紫移）△

En→π*

△

Eπ→π*

△

En→π*

△

Eπ→π*

无溶剂化作用有溶剂化作用ππ*nππ*n第66页，课件共94页，创作于2023年2月

二、显色反应条件的选择（一）显色反应及要求1.显色反应显色剂：能与无色物质生成有色物质的试剂显色反应：将被测组分转变成有色物质的反应常见的显色反应：配位、偶合、氧化还原反应67第67页，课件共94页，创作于2023年2月２．显色反应的要求灵敏度高，一般ε>104;选择性好，干扰少；对照性好：显色剂在测定波长处无明显吸收,△λmax>60nm;反应生成的有色化合物组成恒定，稳定;显色条件易于控制，重现性好68第68页，课件共94页，创作于2023年2月（二）显色反应条件的选择１．显色剂的用量：

M

+

R

MR（待测物）（显色剂）（有色物）

69第69页，课件共94页，创作于2023年2月２.溶液的酸度1）酸度对显色剂颜色的影响许多有机显色剂本身就是酸碱指示剂，当溶液酸度改变时，显色剂本身就有颜色变化2）酸度对显色反应的影响ＨＲＨ＋＋Ｒ－

＋

Ｍ＋

ＭＲ70第70页，课件共94页，创作于2023年2月(3)酸度对金属离子存在状态的影响

当被测离子是容易水解的金属离子时，若酸度低于某一限度，被测离子形成羟基配合物、多核羟基配合物、碱式盐或氢氧化物沉淀，不利于光度分析。71第71页，课件共94页，创作于2023年2月3．显色温度当温度升高：（1）反应速度加快；（2）某些有色配合物发生分解或氧化还原反应；（3）使有色配合物的摩尔吸光系数改变

72第72页，课件共94页，创作于2023年2月A4．显色时间显色反应可能：瞬间完成，长时间内保持不变；迅速完成，但颜色逐渐减退；需要一定时间才能完成。73第73页，课件共94页，创作于2023年2月５.干扰的消除（样品成份较复杂时）

消除办法有：

１）加入配合掩蔽剂

２）加入氧化剂或还原剂

３）选择适宜的显色条件，控制酸度．

４）分离干扰离子74第74页，课件共94页，创作于2023年2月二、测量条件的选择（一）测量波长的选择

1）λmax吸光度大，灵敏度高

2）若λmax处有干扰，只能遵循“吸收大，干扰小”的原则，可选另一灵敏度稍低．但能避免干扰的入射光波长。

75第75页，课件共94页，创作于2023年2月（二）吸光度读数范围的选择光度误差：指的是读数误差为单位百分透光度（ΔT%

=±1%）时所引起的浓度相对误差（ΔC／C）分光光度计的读数标尺：76第76页，课件共94页，创作于2023年2月由于T与浓度c不是线性关系，故不同浓度时的仪器读数误差∆T引起的测量误差∆c/c不同。其中：ΔT→为透光率读数误差

T→为透光率

大多数分光光度计的ΔT在±0.002～0.01之间。77第77页，课件共94页，创作于2023年2月在用分光光度计进行比色测定时，最好控制在：

Ｔ％在15%～65%

A在0.8～0.2之内读数比较合适

而当Ｔ％＝36.8%(T=0.368)

A=0.4343时，误差最小

78第78页，课件共94页，创作于2023年2月（三）参比溶液(referencesolution)的选择也称空白溶液(blanksolution)，作用是调节透光度Ｔ为100%,吸光度Ａ＝０有下列几种，应合理选择：

１）溶剂参比：当溶液中只有待测组分在测定波长下有吸收，而其他组分均无吸收时，可用纯溶剂作参比溶液，称为“溶剂空白”。79第79页，课件共94页，创作于2023年2月２）试剂参比：如果除待测组分外，显色剂和其它试剂在测定条件下也有吸收时，则取与测定试液时所用的显色剂和其它试剂作为参比溶液（只是不加待测组分）３）试样参比：如果只是试样基体有色，而显色剂无色，并且也不与试样基体显色，则用不加显色剂的试样溶液作为参比溶液

80第80页，课件共94页，创作于2023年2月４）平行操作空白：在测量波长下，干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时：①掩蔽被测组分，再加入显色剂,作参比.②加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.81第81页，课件共94页，创作于2023年2月第五节定性与定量分析

一、定性分析1.定性鉴别的依据：光谱特征（光谱形状,吸收峰数目，吸收峰的波长位置，强度和吸收系数等）2.定性分析方法缺陷：只能定性分析化合物所具有的生色团与助色团；光谱信息在紫外-可见光谱范围重叠现象严重。82第82页，课件共94页，创作于2023年2月3.定性鉴别的方法：对比法1）对比吸收光谱的一致性同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较83第83页，课件共94页，创作于2023年2月2）对比吸收光谱的特征值84第84页，课件共94页，创作于2023年2月二、定量分析及应用示例（一）定量分析方法１．标准曲线法

前提：固定仪器和测定条件85第85页，课件共94页，创作于2023年2月例：芦丁含量测定标液：分别移取0.02000mg/ml标样0～5ml→25ml供试液：样品25mg→25ml0.710mg/25mL86第86页，课件共94页，创作于2023年2月２．直接比较法