分子生物学与生物化学实验操作设计与技能

分子生物学与生物化学实验操作设计与技能第1页，课件共41页，创作于2023年2月contentsNorthernBlot2SouthernBlot1WesternBlot3

酶联免疫吸附分析（ELISA）4第2页，课件共41页，创作于2023年2月SouthernBlot原理与用途

原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重排等。第3页，课件共41页，创作于2023年2月SouthernBlot操作步骤DNA琼脂糖电泳

印迹转移

预杂交

杂交（变性探针）

洗膜

放射自显影或显色。第4页，课件共41页，创作于2023年2月SouthernBlot操作步骤：第5页，课件共41页，创作于2023年2月转膜方法毛细管转移法（向上、向下）：DNA片段由液流携带而从凝胶转移并聚集于固相支持物表面。液体通过毛细管作用抽吸过凝胶,借助于一叠干燥的吸水纸巾产生并维持毛细管作用。转移的速率取决于DNA片段的大小和凝胶中的琼脂糖的浓度，小片段DNA（<1kb）在1h内就能从0.7％的琼脂糖上定量的转移。大片段转移慢且效率低。如15kbDNA的毛细管转移至少要进行18h,而且18h后转移仍不完全。电转移：需要使用带电荷的尼龙膜来转移，通常应用于经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的小分子DNA片段。双链DNA片段必须先经过原位变性，随后中和凝胶，并将其浸于电泳缓冲液中，最后将其夹放于大电泳槽内平行电极之间的多孔板之间。完全转移所需的时间取决于DNA片段的大小、凝胶的孔隙度以及外加电场的强度。通常在2－3小时内可以转移完毕。真空转移：在真空条件下，DNA或RNA可以从凝胶上快速并定量地转移。目前商品供应的真空转移装置有数种。真空转移较毛细管转移更为有效，且更为快捷，一般30分钟－60分钟即可完成转移。如果小心操作，经真空转移获得的杂交信号比毛细管法增强2－3倍。第6页，课件共41页，创作于2023年2月Southern印迹及杂交所使用膜的性质

性质硝酸纤维素膜中性尼龙膜带电荷的尼龙膜结合容量（g核酸／CM2）80－120约100400－500实现最大结合能力所需的核酸大小>400bp>50bp>50bp固定真空条件下80C烘烤2h70C烘烤1h,无需真空条件；真空条件下80C烘烤2h70C烘烤1h,无需真空条件；或者温和的碱性条件或者254nm紫外照射；潮湿的膜暴露于1.6kJ/m2;干燥的膜暴露于160kJ/m2商业产品Hybond－NGene－ScreenHybond-N+；Zeta-Probe；Nytran+；Gene-ScreenPlus第7页，课件共41页，创作于2023年2月

转膜过程示意图第8页，课件共41页，创作于2023年2月探针标记技术1标记物：放射性和非放射性两种放射性：32P，35S。非放射性：生物素、地高辛、荧光素。2、标记方法（1）切口平移法：最经典。（2）随机引物法：最常用。（3）末端标记法。（4）单链DNA探针标记。（5）寡核苷酸探针标记法。第9页，课件共41页，创作于2023年2月

放射性探针的标记方法1、切口平移法：目前已经很少使用。2、随机引物法：DNA聚合酶可沿单链模板起始DNA的合成。如果寡核苷酸的序列是随机的，它们就可在模板的多位点上与模板杂交。因此模板上每一核苷酸的互补物将以同样的频率掺入产物。用一种［－32P］标记的dNTP及其他三种非标记dNTP作为前体合成标记DNA,可产生比活为5108-5109dpm/g的探针。第10页，课件共41页，创作于2023年2月

SouthernBlot操作要点一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg的DNA。消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg/μl为好，加入反应体系的酶体积不能超过1/10，DNA样品一定要消化完全。如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于-32P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/μl。鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。

第11页，课件共41页，创作于2023年2月SouthernBlot操作要点在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。

影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。第12页，课件共41页，创作于2023年2月

SouthernBlot注意事项1.要取得好的转移和杂交效果，应根据DNA分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的DNA片段（大于15kb），可在变性前用0.2MHCl预处理10min使其脱嘌呤。2.转移用的膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。3.转移时，注意膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移效果。4.注意同位素的安全使用。5.进行Southern杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。第13页，课件共41页，创作于2023年2月SouthernBlot常见问题分析1、DNA太少，杂交的敏感度不够高；2、DNA太多，酶切不完全，杂交条带不完全；3、使用太高电压电泳：胶熔化或电泳条带没有完全分开；4、预杂交时封闭不完全：背景高，出现无法解释的结果；5、洗膜不充分：背景高，出现无法解释的结果；6、过度洗膜：特异性结合的核酸条带被洗掉；第14页，课件共41页，创作于2023年2月一张同位素放射自显影的Southernblot照片第15页，课件共41页，创作于2023年2月

一张地高辛显色的Southernblot照片第16页，课件共41页，创作于2023年2月Southernblot操作视频第17页，课件共41页，创作于2023年2月NorthernBlot原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。第18页，课件共41页，创作于2023年2月NorthernBlot操作过程

RNA提取

甲醛变性电泳印迹转移预杂交杂交（变性探针）洗膜放射自显影或化学发光第19页，课件共41页，创作于2023年2月Northernblot操作注意事项1.基本注意事项和Southernblot相似;2.获得高质量的RNA是做好Northernblot的关键;3.操作过程要小心、仔细，防止RNA样品的降

解。第20页，课件共41页，创作于2023年2月Northernblot操作视频第21页，课件共41页，创作于2023年2月WesternBlot原理：将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。第22页，课件共41页，创作于2023年2月Westernblot操作过程SDS电泳

转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）封闭一抗洗涤酶标二抗反应洗涤显色或化学发光显影。第23页，课件共41页，创作于2023年2月

SDS－PAGE电泳示意图第24页，课件共41页，创作于2023年2月电泳后转膜，然后用特定的抗体来检测靶蛋白第25页，课件共41页，创作于2023年2月第26页，课件共41页，创作于2023年2月WesternblotanalysisofthecleavageofCaspase-3.IM9/Bcl-2Cellsweretreatedwith20Mofgossypolfor4,8and16h.Aftertreatment,cellswereharvestedandlysedinlysisbuffer.50ugofproteinwasloadedineachlaneandtheexpressionofactinwasdetectedasaloadingcontrolHours04816第27页，课件共41页，创作于2023年2月WesternBlot实验注意的问题（1）蛋白质电泳：常用SDS：单一亚基组成的蛋白质非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质Tris-Tricine胶电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套！第28页，课件共41页，创作于2023年2月WesternBlot实验注意的问题（2）转膜：戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致！以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极。排去滤纸、胶和膜间的气泡。电转时间：100V1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活选择。转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率。膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置。第29页，课件共41页，创作于2023年2月WesternBlot实验注意的问题（3）封闭：用5％脱脂奶粉或3％BSA。（含0.1％Tween20TBS或PBS配制）时间：室温2h或4ºC过夜第30页，课件共41页，创作于2023年2月WesternBlot实验注意的问题（4）显色或显影：显色：辣根过氧化物酶：底物为DAB。碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT。化学发光显影：最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次，

曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定。第31页，课件共41页，创作于2023年2月WesternBlot实验注意的问题（5）膜的再利用：化学发光后的硝酸纤维素膜用StrippingBuffer洗涤后（洗涤Buffer:62.5mmpH6.7的Tris-HCI含2％SDS和100mm的－2ME），用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交。第32页，课件共41页，创作于2023年2月Westernblot操作视频第33页，课件共41页，创作于2023年2月ELISA原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。第34页，课件共41页，创作于2023年2月ELISA常用的酶和底物

辣根过氧化物酶，底物为OPD,深桔黄色，检测波长492nm；底物为TMB，蓝绿色，检测波长450nm。

碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯）,黄色，检测波长405nm。

ELISA各步骤的反应时间：

包被：24－36h，蛋白浓度为1－5ug/ml。

封闭：37ºC2h

或4ºC过夜（3％BSA）。

样本反应时间：37ºC45min-1h。

酶标抗体反应时间：37ºC45min-1h。显色时间：15min(避光）。

实验要设对照。

可以一次包被多块板，冻存备用。第35页，课件共41页，创作于2023年2月ELISA的类型1.间接法测抗体：间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。方法：抗原包被封闭待检抗体洗涤酶标二抗洗涤显色反应终止反应ELISAReader检测OD值。第36页，课件共41页，创作于2023年2月ELISA的类型2.双抗体夹心法测抗原：是检测抗原最常用的方法。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。常用的组合：单克隆抗体＋多克隆抗体

单克隆抗体＋单克隆抗体

后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用

于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。第37页，课件共41页，创作于2023年2月ELISA的类型3.竞争法测抗原：(1)抗体固相测抗原：小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。方法：抗体包被封闭同时加入待测抗原和酶标抗原洗涤酶底物显色