环磷酸腺苷高产菌落研究-生物工程毕业论文定稿

——学院2014届本科毕业论文论文题目：环磷酸腺苷高产菌落研究学生姓名：——所在院（系）：生物工程系所学专业：生物工程专业导师姓名：——完成时间：2014年3月15日环磷酸腺苷高产菌落研究——（——学院生物工程系104班）摘要微生物发酵法合成环磷酸腺苷（cAMP）高产菌种是关键，本文采用高效液相色谱法测定不同菌落发酵液中环磷酸腺苷的含量筛选出cAMP高产菌落。通过活化不同节杆菌，挑选单菌落，分别编号1至6后移种进行发酵，发酵结束后用高效液相色谱法测定发酵液中cAMP含量,结果6号菌落发酵液中cAMP含量最高为2.8957mg/ml，其次为4号菌落，环磷酸腺苷含量为2.5057mg/ml。本实验初步筛选出环磷酸腺苷高产菌落为6号菌落；同时也发现在实验中无菌操作是否规范、能否避免染菌是我们实验成败的关键。关键字：环磷酸腺苷，节杆菌，发酵，高效液相THEEFFECTOF：UsinghighperformanceliquidCyclicadenosinephosphatehigh-yieldstrainsscreened——(——School,DepartmentofBiologicalEngineering，Class104)ABSTRACTMicroorganismfermentationwassynthesizedadenosinemonophosphate(cAMP)highyieldstrainisthekey,thispaperadoptshighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodfordeterminingthecontentofcentraladenosinephosphateofdifferentcoloniesfermentedliquidscreenedcAMPhigh-yieldcolony.Throughactivationofdifferentsection,selectsinglecolony,number1to6backkindofferment,respectivelyafterfermentationcAMPcontentinthefermentedliquidbyhighperformanceliquidchromatography(HPLC)method,theresults6coloniescAMPcontentinthefermentedliquidupto2.8957mg/ml,followedbycolony,4cyclicadenosinephosphatecontentis2.5057mg/ml.Thisexperimentpreliminaryscreeningcyclicadenosinephosphatehigh-yieldcolonyfor6colonies;Alsofoundintheexperimentofsterileoperationwhetherstandard,whethertoavoiddyebacteriumiskeyofsuccessorfailureinourexperiment.Keywords:Cyclicadenosinemonophosphate,Arthrobacterium,BiologicalFermentation，HPLC目录1引言： 11.1环腺苷酸的物理化学性质和生物学功能 11.2环磷酸腺苷生产机制 22.材料与方法 32.1实验材料 32.2实验仪器 32.3实验方法 32.3.1培养基 32.3.2移种与接种 32.4高效液相检测环磷酸腺苷含量 42.4.1色谱测定条件 42.4.2样品处理 42.4.3标样的配制 42.4.4标样的线性关系 52.4.5标准曲线绘制 53.实验结果与分析 53.1实验结果 53.1.1摇瓶发酵各参数测定 53.1.2高效液相测定发酵液中环磷酸腺苷的含量 63.2结果分析及讨论 124结论 13参考文献 14致谢: 15环磷酸腺苷高产菌落研究李成喜（新科学院生物工程系104班）1引言：环磷酸腺苷是核苷酸类药物,在临床上,主要用于治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死,尤其适用于对洋地黄类强心药中毒或不敏感的患者[1]。同时cAMP是机体代谢的重要调节因子，其广泛参与酶活性调节、基因表达以及细胞增殖与分化等，因而备受关注。上个世纪五、六十年代起,国外就陆续有文献报道环磷酸腺苷的合成。但传统的cAMP以化学合成为主，生产成本高，而且含有致癌致畸的化学残留物，不适于临床应用[2]。现在也有从大枣中提取，原料质量要求高，处理过程繁杂且cAMP回收率较低。本研究利用节杆菌通过微生物发酵生成cAMP，具有很大发展前景[3]。环腺苷酸(CyclicAdenosineMonophosphate,cAMP)是由E.W.Sutherland于1957最早从哺乳动物组织中发现的，并于1958年分离出环腺苷酸。Sutherland也因发现cAMP于1971年获得生理和医学诺贝尔奖[4]。之后，人们相继从植物和微生物中发现了环腺苷酸，并证明二者是生物界普遍存在的两种生物活性物质。世界各国的研究人员通过对cAMP大量的研究,结果表明cAMP在很多领域中起着重要的作用。所以cAMP的生产和检测是十分重要而且必要的。高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）分析cAMP含量不仅简便快速,而且选择性好、准确度高。1.1环腺苷酸的物理化学性质和生物学功能环磷腺苷，即：腺嘌呤核苷-3′，5′-环磷酸酯,简称cAMP，是由单核苷酸AMP分子中的磷酸与核糖形成3'，5'－环式结构（见图1）其分子式为:Cl0H12N5O6P，水合物为类白色或淡黄色结晶，微溶于水，不溶于乙醇或乙醚熔点为219～220℃(分解)，比旋度为－51.3°(C=0.67)；它对酸、碱、热都相当稳定，是当前分子生物学研究的热点之一[3,4]。cAMP是人体中的一种重要生物活性物质，它在细胞内外快速双向流动，细胞内产生的cAMP可透过细胞膜进入体液中，胞外的cAMP可被细胞摄取。同时环磷酸腺苷酸也是细胞内传递激素和递质的中介因子，并作为第二信使参与多种生理生化过程的调节，在蛋白质的合成过程中,基因的转录和翻译都受到cAMP的影响。环磷酸腺苷也可作为药物中间体制备二丁酰环磷腺苷和环磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而发挥更有效的生理及药理作用。环磷酸腺苷还可用于畜禽食品添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。因此,研究工作和医学临床试验均需大量的cAMP。图1环腺苷酸结构式1.2环磷酸腺苷生产机制环磷酸腺苷的合成主体上可分为两大类，一是通过化学法合成；二是通过生物体合成。从上个世纪五、六十年代起，一系列的化学方法被用于合成环磷酸腺苷，如：碱性水解法、活性酯类法、DCC脱水法和三氯氧磷法[6]等。生物体合成是利用生物细胞的新陈代谢生成环磷酸腺苷。利用微生物合成cAMP，可分为发酵法，酶法。发酵法又分分段合成法和全合成法；酶法又分腺苷酸环化酶法和RNA分解法。本研究主要是利用微生物发酵法中的分段合成法，通过在含有碳源氮源的基本培养基上添加前体物质，通过培养微生物细胞获得大量的环磷酸腺苷。微生物cAMP的生物合成途径[7]如图2所示。图2细菌图2细菌的cAMP生物合成途径与反馈调节（）（Acase为腺苷酸环化酶；PDase为磷酸二酯酶）cAMP的积累机制：(1)底物的摄取；(2)cAMP合成酶的开始；(3)生成的cAMP向细胞外分泌漏出。2.材料与方法2.1实验材料实验室存放活化后的节杆菌斜面。2.2实验仪器超净工作台、恒温培养箱、回转式摇床、离心机、立式灭菌锅、还原糖自动测定仪、高效液相色谱仪、平板式加热器、双筒显微镜、培养皿、pH试纸、试管、移液管、酒精灯、吸耳球、烧杯、量筒、玻璃棒2.3实验方法2.3.1培养基种子培养基：葡萄糖2%，蛋白陈1%，酵母膏5%，pH7.0[7,8]；种子培养基的配制：称取4.0g葡萄糖，2.0g蛋白胨，10.0g酵母膏，溶于200ml蒸馏水中，调ph至7.0后分装于6个250ml的三角瓶中，再用8层纱布和双层报纸包扎瓶口灭菌备用。发酵培养基：葡萄糖5%，KH2PO41%，K2HPO41%，ZnSO4·7H2O

0.01%，蛋白胨1%，酵母膏0.5%，次黄嘌呤0.3%[7,8,9]；发酵培养基的配制：称取30g葡萄糖，6gKH2PO4，6gK2HPO4，0.06gZnSO4·7H2O，6g蛋白胨，3g酵母膏，1.8g次黄嘌呤，溶于600ml蒸馏水中，为了加快磷酸盐的溶解可适当加热，完全溶解后调ph至7.5后分装于18个250ml的三角瓶中，每瓶30ml，用8层纱布和双层报纸包扎瓶口，并包6支5ml移液管与发酵培养基一起灭菌备用。2.3.2移种与接种将活化后的斜面种子移种至种子培养基8层纱布包扎三角瓶口28℃恒温摇瓶震荡培养18小时以上，再接种至发酵培养基，接种量10%(V/V)[7]，8层纱布包扎三角瓶口30℃恒温摇瓶震荡培养72以上小时。移种：超净工作台紫外照射30分钟至1小时，关紫外灯开照明灯，开鼓风机。挑选6个长势较好的不同菌落分别进行移种,每个菌落移种一个发酵瓶.具体操作如下:左手持活化试管，并将三角瓶封口解开，放置酒精灯火焰附近。右手取接种环在火焰上灼烧灭菌、伸入斜面试管内部冷却。用接种环轻轻划取斜面上的菌苔，再伸入三角瓶种子培养液轻轻搅动使菌体溶到培养液中；重复2到3次。移种完成后将三角瓶瓶口外层的2层报纸弃去，直接用8层纱布包扎，但不要污染瓶口处纱布。从超净工作台中取出种子培养瓶后28℃恒温摇瓶震荡培养18小时以上，待生长到对数生长后期时移种至发酵培养液中。接种：超净工作台准备如移种方法。在超净工作台中解开封口，每瓶种子液接种3瓶发酵样瓶，分别编号11至13，21至23，31至33，41至43，51至53，61至63并用记号笔做好标记。用移液管吸取3ml种子液分别接种到已编号的发酵样瓶，同样弃去封瓶口的上层的2层报纸，在不污染瓶口纱布的情况下包扎瓶口后30℃恒温摇瓶震荡培养72小时以上。2.4高效液相检测环磷酸腺苷含量2.4.1色谱测定条件柱温为室温；柱压：19.11MPa；流速：1mL/min；波长：254nm；进样量：20μL；色谱柱：SinoChromODS-BP5μm；柱长：150×4.6mm。[4,5]流动相为V(甲醇):V(磷酸溶液)=25:75；磷酸溶液浓度为0.6%。流动相中只包含甲醇和磷酸溶液。将配置好的流动相加热至70度左右，根据需要选择0.45μm的滤膜，然后对流动相进行抽滤。抽滤后对流动相进行超声脱气10至20分钟，备用[10,11]。2.4.2样品处理发酵结束后得到的发酵液用5ml移液管移取3ml于3ml离心管中，每次移取发酵液时要用待移发酵液润洗2至3次。离心管在5000转每分钟下离心15分钟。离心结束后取上层清液，再经0.45μm针式虑头过滤后待测。2.4.3标样的配制精密称取cAMP标准品1000mg，用去离子水溶解并定容至100ml容量瓶中，即得到环腺苷酸标准品溶液，浓度为10mg/ml。精密称量次黄嘌呤标准品54mg，用去离子水溶解定容与100ml容量瓶中，得到次黄嘌呤标准溶液,浓度为0.54mg/ml。[3,11]2.4.4标样的线性关系精密吸取cAMP标准液1ml、2ml、4ml、8ml、16ml、32ml分别定溶于50ml容量瓶中配制成0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mg/ml六份标准液，在上述色谱条件下进样20μl[4,5]，记录色谱峰面积。环磷酸腺苷和次黄嘌呤的高效液相扫描图谱如3.1.2中图4，图5所示。在0.2mg/ml至6.4mg/ml浓度范围内，色谱峰面积与样品中环磷酸腺苷含量线性关系良好，线性关系图如2.4.3中图3所示。2.4.5标准曲线绘制照2.3.1色谱条件，将处理好的样品溶液与标准品溶液放入自动进样器分别进行扫描测定其峰面积。以峰面积为横坐标，浓度（mg/mL）纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，y=22948.598x-1475339.6，R²=0.9979。标准曲线见图3，样品扫描结果见3.1.2。图图3环腺苷酸标准曲线3.实验结果与分析3.1实验结果3.1.1摇瓶发酵各参数测定发酵结束后，按编号排好发酵瓶进行参数测定。第一步：用50ml量筒量取各个发酵瓶中发酵液体积，做好记录。第二步：用玻璃棒蘸去适量发酵液，滴在5.0至9.0量程的ph试纸上30秒内与标准比色卡对比测定ph，做好记录。第三步：用5ml移液管移取3ml发酵液于3ml离心管中5000转每分钟，离心15分钟。用移液管移取发酵液前，先用待移发酵液润洗2到3次。第四步：取上层清液适量按上述色谱测定条件进样做高效液相测定。第五步：取上层清液适量于还原糖自动测定仪中测定发酵液中剩余还原糖的残糖量，做好记录。结果如表1。表1摇瓶发酵体积、pH、残糖结果编号发酵液体积（ml）Ph残糖量11276.72.67812265.50134521276.72.82822296.72.94723286.72.86331277.02.96832246.73.02833275.5041276.72.60044043286.72.64251296.72.70152296.72.72253276.72.71261296.71.57162286.72.24763256.72.2163.1.2高效液相测定发酵液中环磷酸腺苷的含量环磷酸腺苷标准品高效液相图如图4，次黄嘌呤标准品的高效液相图如图5图4环腺苷酸标准品的高效液相图图5次黄嘌呤标准品的高效液相图不同菌落发酵液样品高效液相图谱如图6至图23所示。图6菌落11高效液相图图7菌落12高效液相图图8菌落13高效液相图图9菌落21高效液相图图10菌落22高效液相图图11菌落23高效液相图图12菌落31高效液相图图13菌落32高效液相图图14菌落33高效液相图图15菌落41高效液相图图16菌落42高效液相图图17菌落43高效液相图图18菌落51高效液相图图19菌落52高效液相图图20菌落53高效液相图图21菌落61高效液相图图22菌落62高效液相图图23菌落63高效液相图由高效液相图分析得到各编号发酵液中环腺苷酸的含量如表2表2发酵液中cAMP含量编号cAMP含量（mg/ml)112.249120.406132.344211.640221.338231.418310.591320.557330.547412.530422.583432.404511.995521.765531.980613.018622.729632.940菌落1至6发酵液环磷酸腺苷的平均含量如表3所示表3环磷酸腺苷平均含量菌落编号环磷酸腺苷平均含量(mg/ml)菌落12.2965菌落21.4653菌落30.574菌落42.5057菌落51.9133菌落62.89573.2结果分析及讨论由3.1.2中不同菌落发酵液样品高效液相图6至图23分别与图4环磷酸腺苷、图5次黄嘌呤的标样图进行对比可以看出,发酵液中产生的两个吸收峰与标样图的吸收峰几乎在同一位置，说明发酵液中由微生物合成了一定量的环磷酸腺苷，同时也说明了发酵液中有一定量的次黄嘌呤残余。在发酵培养基的配制中添加了0.3%的次黄嘌呤，由于微生物是将次黄嘌呤作为中间物进行代谢利用，而不是作为碳源、氮源，所以需求量少。因此在发酵液中有一定量的次黄嘌呤残余是正常情况。将各发酵液的高效液相图中cAMP的波峰面积算出，再利用2.2.4中的标准曲线求得发酵样品中环磷酸腺苷的含量。最后得到的各发酵样品中cAMP含量如3.2.1中表1所示。由表1测定结果可以看出编号12和编号33的发酵瓶有些异常，ph和还原糖的残糖量都异于其他编号。这两瓶发酵液中还原糖的残余量为零，涂片后显微镜观察发现有其他非棒状杆菌和少量棒状杆菌，由此断定染菌，认定这两瓶发酵失败。在计算菌落环磷酸腺苷的平均值时，编号12和编号23的cAMP含量值不计算在内。其他各瓶发酵液ph基本一致，均含有少量还原糖，发酵状况认为正常。由表2所得各瓶发酵液中环腺苷酸的含量对比发现还原糖的残糖量越低，则发酵液中环腺苷酸cAMP的含量越高。根据表3不同菌落发酵液中cAMP平均含量的计算结果，发现编号为6的菌落的发酵液中cAMP的平均含量最高为2.8957mg/ml，其次为菌落4环磷酸腺苷的平均含量为2.5057mg/ml，平均含量最低的是菌落3含量为0.574mg/ml。不同的菌落生产环磷酸腺苷的能力差别较大，同一菌落的不同发酵样瓶中环磷酸腺苷的含量也不尽相同。初步分析主要原因有两个，一是用于实验的菌落可能只达到菌落纯，未达到菌株纯；二是可能由于实验过程中偶然的外界因素对单个发酵瓶产生了影响。若对菌落6进一步进行纯种分离纯化实验，规范实验操作定能筛选出环磷酸腺苷高产菌株。染菌分析：由于各发酵培养基是一起进行高压真气灭菌，只有两瓶发酵失败，推断培养基灭菌是彻底的，染菌可能是在进行发酵接种时污染杂菌。在今后的无菌操作时，要特别加以小心注意。微生物发酵染菌是发酵过程中比较重要的问题，如何避免染菌是发酵成败的关键。可从以下几方面给于避免：一、确定种子不带杂菌，从而可从源头上避免杂菌污染；二、培养基灭菌要彻底，一般采用高压蒸汽121℃，15分钟到20分钟；三、在种子液进行移种和接种时的无菌操作要规范，通常在超净工作台中进行，发酵瓶瓶口要靠近酒精灯火焰；四、接种过程瓶口不要对着风屏，尽可能是与风向平行，超净工作台中鼓风机的采风口要保持清洁卫生，避免鼓入空气带菌。4结论国内外目前生产cAMP多数是用腺苷和5′-腺苷酸作为起始原料合成环磷腺苷。以化学合成为主，操作复杂，溶剂损耗量大，收率低成本高，产量小，而且含有致癌致畸的化学残留物，不适于临床应用。现也有人研究从大枣中提取环腺苷酸，但限于原料质量要求高，处理过程繁杂且cAMP回收率较低不易推广。通过本次试验，初步说明环腺苷酸的生产除了通过化学合成和从生物细胞中提取外，还可以利用微生物发酵进行生产。通过初筛获得高产菌落6和菌落4，若能进一步对菌落进行分离纯化定能筛选出高产稳定的纯菌株。将环腺苷酸的生产与生物技术相结合，从而可以使环腺苷酸的生产周期短，分离提纯容易，产品具有无化学残留污染的优点，具有广阔的发展前景。参考文献[1]王丽，蒋宗勇，林映才.环腺苷酸（cAMP）及其抗病生物学作用.饲料工业，2009[2]牟德华，朱艳丽.大枣环腺苷酸及其生物学功能.食品科技.2007,河北科技大学生物科学与工程学院[3]张明娟，李薇，庞晓明.枣果中环磷酸腺苷(cAMP)的提取工艺及含量测定.食品与发酵工业.2012，北京林业大学生物科学与技术学院[4]李学贵,蒋文强,王传芬.HPLC法测定大枣提取液中环腺苷酸含量的研究.山东化工.山东轻工业学院食品与生物工程学院[5]崔志强,孟宪军,王传杰.HPLC法测定冬枣环磷酸腺苷含量.食品研究与开发.沈阳农业大学食品学院[6]赵晋，田茂奎，唐巍.环磷腺苷合成工艺研究概述.理工科研，2008，西南大学化学化工学院[7]张克旭.环腺昔酸(cAMP)发酵的菌种选育与调节机制.发酵科技通讯，1980，天津轻工学院[8]应汉杰.一种微生物生产环腺苷酸的方法.南京工业大学.专利申请[9]CHEN,X.C.ETAL.:'Mediumoptimizationfortheproductionofcyclicadenosine3',5'-monophosphatebyMicrobacteriumsp.no.205usingresponsesurfaceMethodology'BIORESOURCETECHNOLOGYvol.100,no.2,2009,pages919-924[10]蒲云峰，万英，侯旭杰.HPLC法测定不同品种红枣中cAMP含量.食品研究与开发.新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室[11]王荔，亓树艳，莫晓燕.大枣环磷酸腺苷提取纯化工艺的初步研究.食品科技.提取物与应用.2012,西安交通大学生命科学与技术学院致谢:经过近两个月的实验和整理论文，毕业设计即将结束，同时也标志着我的大学生活即将接近尾声。大学四年来在老师和同学们的帮助下，我努力学习掌握各种专业知识以及培养自己各方面的能力，尽自己的能力完成了我的学业。这次的毕业设计是一次交流和学习的机会，整个实验和论文整理过程是一个不断学习、不断提高自己、积累自己经验的过程，我从中学到了很多新知识，更培养了自己的信心和毅力。在今后的工作和学习中，我会继续发扬这段时间各项好的习惯和作风，努力做好以后的每一项工作。本文是在——师的悉心指导下完成的，在跟随常老师做实验期间从她身上我学到的不仅仅是知识和实验技能的操作,更多的是做人为事的道理。常老师治学严谨,要求严格，为人和蔼,对我今后的学习工作都有很大帮助，同时在完成本实验时也得到了康老师和实验室其他老师在实验试剂、实验药品、实验仪器和实验操作等方面提供的帮助和指导，及试验组全体同学的协助，在此一并表示衷心的感谢！基于C8051F单片机直流电动机反馈控制系统的设计与研究基于单片机的嵌入式Web服务器的研究MOTOROLA单片机MC68HC（8）05PV8/A内嵌EEPROM的工艺和制程方法及对良率的影响研究基于模糊控制的电阻钎焊单片机温度控制系统的研制基于MCS-51系列单片机的通用控制模块的研究基于单片机实现的供暖系统最佳启停自校正（STR）调节器单片机控制的二级倒立摆系统的研究基于增强型51系列单片机的TCP/IP协议栈的实现基于单片机的蓄电池自动监测系统基于32位嵌入式单片机系统的图像采集与处理技术的研究基于单片机的作物营养诊断专家系统的研究基于单片机的交流伺服电机运动控制系统研究与开发基于单片机的泵管内壁硬度测试仪的研制基于单片机的自动找平控制系统研究基于C8051F040单片机的嵌入式系统开发基于单片机的液压动力系统状态监测仪开发模糊Smith智能控制方法的研究及其单片机实现一种基于单片机的轴快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于双单片机冲床数控系统的研究基于CYGNAL单片机的在线间歇式浊度仪的研制基于单片机的喷油泵试验台控制器的研制基于单片机的软起动器的研究和设计基于单片机控制的高速快走丝电火花线切割机床短循环走丝方式研究基于单片机的机电产品控制系统开发基于PIC单片机的智能手机充电器基于单片机的实时内核设计及其应用研究基于单片机的远程抄表系统的设计与研究基于单片机的烟气二氧化硫浓度检测仪的研制基于微型光谱仪的单片机系统单片机系统软件构件开发的技术研究基于单片机的液体点滴速度自动检测仪的研制基于单片机系统的多功能温度测量仪的研制基于PIC单片机的电能采集终端的设计和应用基于单片机的光纤光栅解调仪的研制气压式线性摩擦焊机单片机控制系统的研制基于单片机的数字磁通门传感器基于单片机的旋转变压器-数字转换器的研究基于单片机的光纤Bragg光栅解调系统的研究单片机控制的便携式多功能乳腺治疗仪的研制基于C8051F020单片机的多生理信号检测仪基于单片机的电机运动控制系统设计Pico专用单片机核的可测性设计研究基于MCS-51单片机的热量计基于双单片机的智能遥测微型气象站MCS-51单片机构建机器人的实践研究基于单片机的轮轨力检测基于单片机的GPS定位仪的研究与实现基于单片机的电液伺服控制系统用于单片机系统的MMC卡文件系统研制基于单片机的时控和计数系统性能优化的研究基于单片机和CPLD的粗光栅位移测量系统研究单片机控制的后备式方波UPS提升高职学生单片机应用能力的探究基于单片机控制的自动低频减载装置研究基于单片机控制的水下焊接电源的研究基于单片机的多通道数据采集系统基于uPSD3234单片机的氚表面污染测量仪的研制基于单片机的红外测油仪的研究96系列单片机仿真器研究与设计基于单片机的单晶金刚石刀具刃磨设备的数控改造基于单片机的温度智能控制系统的设计与实现基于MSP430单片机的电梯门机控制器的研制基于单片机的气体测漏仪的研究基于三菱M16C/6N系列单片机的CAN/USB协议转换器基于单片机和DSP的变压器油色谱在线监测技术研究基于单片机的膛壁温度报警系统设计基于AVR单片机的低压无功补偿控制器的设计基于单片机船舶电力推进电机监测系统基于单片机网络的振动信号的采集系统基于单片机的大容量数据存储技术的应用研究基于单片机的叠图机研究与教学方法实践基于单片机嵌入式Web服务器技术的研究及实现基于AT89S52单片机的通用数据采集系统基于单片机的多道脉冲幅度分析仪研究机器人旋转电弧传感角焊缝跟踪单片机控制系统基于单片机的控制系统在PLC虚拟教学实验中的应用研究基于单片机系统的网络通信研究与应用基于PIC16F877单片机的莫尔斯码自动译码系统设计与研究基于单片机的模糊控制器在工业电阻炉上的应用研究基于双单片机冲床数控系统的研究与开发基于Cygnal单片机的μC/OS-Ⅱ的研究基于单片机的一体化智能差示扫描量热仪系统研究基于TCP/IP协议的单片机与Internet互联的研究与实现变频调速液压电梯单片机控制器的研究基于单片机γ-免疫计数器自动换样功能的研究与实现基于单片机的倒立摆控制系统设计与实现单片机嵌入式以太网防盗报警系统基于51单片机的嵌入式Internet系统的设计与实现单片机监测系统在挤压机上的应用MSP430单片机在智能水表系统上的研究与应用HYPERLINK"/detail.htm?3