野生与栽培甘草药用成分含量差异形成的基因机制

5.3.3与野生甘草快速积累药用成分相关的基因机制探讨因此，为了能够更全面的研究野生与栽培甘草药用成分含量差异的实质，我们从EST的角度出发，利用抑制性差减杂交技术，构建了野生甘草快速积累药用成分的SSH-cDNA文库，通过EST测序和生物信息学分析，就野生甘草快速积累药用成分方面的功能做出了初步的推测。野生甘草根在积累药用成分的速度上区别于栽培甘草根的内在原因可能和以下这些基因的表达有关:谷胧甘肤一S一转移酶(glutathioneS-transferaseGST24)、查尔酮合酶(chalconesynthase,CHS)、富含脯氨酸蛋白(prolinerichprotein).S_腺普甲硫氨酸合成酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL),聚酮还原酶(GGPKR2),1,3-}-D葡葡糖普酶、聚泛素蛋白和热休克蛋白HSP70o谷脆甘肤-S一转移酶(glutathioneS-transferase,GST)是植物在生物与非生物胁迫中清除活性氧的化合物之一。它可催化亲核性的谷胧甘肤与各种亲电子外源化合物的结合反应[y2s}。更有研究显示，GST在高等生物体内能够防御NO对细胞的损害y2}}。本文库中的ghztathioneS-transferaseGST24参与细胞色素P450外源物质的代谢。(表5-3)而植物细胞色素P450是高等植物中最大的酶蛋白家族，被人们称为万能的生物催化剂，其可催化合成菇类、黄酮类、植物激素等多种生物物质的合成.我们可以推测，野生甘草由于长期受外界不良环境的影响，glutathioneS-transferaseGST24表达量增加，进而导致其体内细胞色素P450基因表达量增加，从而催化甘草中主要药用成分甘草酸和黄酮类等物质的积累。目前已有人从甘草中分离得到的基因CYP88D6和CYP72A154，其应CYP72A154编码的P450单加氧酶催化尽香树脂醇(,8-amyrin)的C-30氧化反应[83]。另外，来自同一甘草cDNA文库的F2H基因(P45。的一种)也已经被克隆[[129]其在调控甘草中黄酮类化合物生物合成中起到重要的作用:在植物体内，黄酮类化合物是一类重要的次生代谢产物，在植物的抗紫外线灼伤、抗胁迫和外源基因的表达等过程中均起着起着重要的作用。其生物合成途径起始于苯丙烷代谢途径[[93]，而查尔酮合酶(chalconesynthase,CHS)则是苯丙烷类合成途径中的第1个关键酶和限速酶，它催化3分子的丙二酞辅酶A与1分子对经基苯丙烯酞辅酶A缩合成袖皮素查尔酮，以此为支架从而衍生出其他黄酮类化合物!93,130]。有研究认为，CHS也可被脯氨酸诱导而大量表达[‘川，而脯氨酸是植物蛋白质的组分之一，以游离的状态广泛存在于植物体中。在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻)，植物体内脯氨酸的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸[132,133]。本文库得到的contig48和78分别编码prolinerichprotein和chalconesynthase，由此我们可以推测，野生甘草极有可能是由于受到干旱的刺激，大量的脯氨酸开始积累，并进而诱导CHS的表达量随之增加，从而导致野生甘草中总黄酮的含量要远远高于栽培甘草。甲硫氨酸与ATP在S一腺普甲硫氨酸合成酶的催化下可生物合成S一腺普甲硫氨酸。S-腺普甲硫氨酸是生物体内重要的代谢中间物，参与了植物体内的转氨丙基、转甲基和转硫等多种重要的生理过程，与多胺、乙烯和谷胧甘肤的合成等生化反应密切相关，是多胺、乙烯和谷胧甘肤等生物合成的前体。而多胺、乙烯和谷胧甘肤都参与了多种植物的防御干旱、高盐以及低温等逆境胁迫的过程，如小麦、大豆、花生等[(134,136,136]。而研究显示，甘草在受这些逆境胁迫的影响，甘草酸等次生代谢物质大量积累[66,137]。由此，可以推测，本文库中contig18编码的S一腺普甲硫氨酸合成酶在甘草植物体内可能也有类似的活性，从而最终影响甘草药用成分的快速积累。甘草属于喜光植物，其分布区域的年太阳总辐射量一般在120千卡/平方厘米，年日照时数多在250。小时以上[l38]。研究表明，光照可激活苯丙烷代谢途径，随光照强度的增加，苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性升高。而PAL是苯丙烷次生代谢途径合成黄酮类化合物以及木质素等多种次生物质的关键酶[139,140]aJiang等【14i]报道，增加紫外辐射可以使玉米叶片中PAL酶活性增加，从而导致总黄酮含量明显增加。王云生等I}4z}证明光照可能以光信号或者胁迫信号引起胞内第二信使cAMP和Cat+产生，从而调控细胞生长和苯丙烷次代谢物的积累。Teklemariam等[[i4}}研究证明，紫外线可以诱导PAL活性的提高，并且诱导是发生在转录水平上。本文库中contig27编码PAL的表达，原因可能是野生甘草生长年限较长，接受的光照时间比较长，而且其在生长过程中分布比较分散，接受的光照面积比较大，从而导致体内积累的PAL远高于栽培甘草，因此总黄酮的合成量也要高于栽培甘草。Hayashi等[[144]研究光果甘草中发现了聚酮还原酶(GGPKR2)。研究表明，其可以与查尔酮合酶共同作用产生异甘草素，进而在CHI的作用下生成甘草素。此外，1,3-p-D葡葡糖普酶在植物体内广泛存在，是能够水解结合于末端非还原性的p-D葡葡糖键，同时释放出[3-D葡葡搪和相应的配基。可以推测，在本文库中，contig40编码的聚酮还原酶(GGPKR2)，在与查尔酮合酶共同作用下产生异甘草素，进而在CHI的作用下生成甘草素。contig52编码的1,3-}3-D葡葡糖普酶的存在也促进甘草普和异甘草普进一步裂解，产生其分别对应的普元，即甘草素和异甘草素。从而导致野生甘草中的甘草素和异甘草素均明显高于栽培甘草。聚泛素蛋白可以介导选择性地降解冗余的蛋白质，在环境胁迫、胞内代谢、细胞凋亡和细胞分裂周期旺盛等多种因素的调节下会产生一些诱导型蛋白，当逆境消失时这些蛋白也随之被降解[yas}热休克蛋白HSP70作为一组诱导型表达蛋白。在正常细胞中并不表达或表达量很少，但是在热应激或其他应激原的作用下，则表达迅速增加。受到逆境胁迫后，表达量升高，促使植物自身产生应答或防御反应h}l在构建的野生甘草快速积累药用成分的SSH-cDNA文库中，通过对得到的EST序列与已知植物序列在蛋白质水平上进行同源性比较，结合上述甘草主要药用成分的生物合成途径，为野生与栽培甘草药用成分积累速度差异的产生找到分子上的证据，从而揭示野生甘草与人工甘草质量差异的实质。同时通过深入挖掘野生甘草快速积累药用成分的基因共表达机制，为优质甘草培育生产实践奠定理论基础。6.1.3与野生甘草快速积累药用成分相关的特异性EST筛选研究为深入探讨野生甘草快速积累药用成分的基因机制，本研究以相同栽培模式下，繁殖两年的野生不定根和栽培实生根为材料，应用抑制性差减杂交(SSH)技术对二者的差异基因进行筛选研究。通过正向差减文库共克隆得到了621条ESTs序列，通过对这些ESTs序列进行聚类拼接后，共得到168条unigenes，其中包括55条contigs和113条singletons。序列长度范围为78}1017bp，平均长度为278bp。分别对得到的unigenes进行Nr,swissport,COG,GO,KEGG基因注释和功能分类，初步推测与野生甘草快速积累药用成分的基因机制可能和以下这些基因的表达有关:谷耽甘肤-S一转移酶(