第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定

1第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能到达克隆的目的。一、重组DNA分子转入原核生物细胞1.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化〔transformation〕——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。〔1〕CaCl2处理后的细菌转化或转染汁A毁、制照备感剪受态府细胞属受体看细胞工的细歇菌，冻经一俯定浓涂度的士冰冷斤的叉C姨aC仙l球2乖〔鲁50泊～蛾10着0子mm巩ol逢／妻L栗〕溶筑液处拾理后林变成丈。末所谓章感受示态细偷胞咏，处暑在感慧受态得状态读的菌敌体有已摄取鸭各种黑外源撑D睬NA闲的能腿力。鬼转化处：感稍受态振的大尺肠杆贪菌细革胞捕稠获和曾表达衔质粒窗载体横DN痕A欺分子松的生唉命过拥程；拒转染稠：感翅受态弃的大排肠杆把菌细氧胞捕物获和义表达弹噬菌短体锈DN龙A紫分子光的生富命过粗程；扭好的凝感受墓态细梳胞，而每微年克的钳超螺芬旋质蚕粒笛DN颠A声可得牙5英×休10世7朱个转废化体眉。修B材、细框胞转偷化〔刃或转总染〕喇的具串体操狂作过套程：腊①总将处昨于对抄数期河的新炸鲜培呈养物白于市0匪℃奴40胜00框转织/慧别离怖心女10属分，俭回收幕细菌哨细胞吗；早②斧将细抽胞用稀0移℃塞的形0.种1m尿ol拦/L懂C敢aC知l纽2缸低渗沙溶液眯处理吃30睁分钟虽，离笨心回剂收细降胞，惊再用停适量匠0维℃脱的晚0.召1m脾ol脚/L跑C悼aC挂l丹2舱重悬晌细胞际，以赛诱导宏感受钓态产忌生。地③绘参加述适量数DN迁A两，于稀42涛福℃底热处惹理混谋合物叶90畜秒，喝使洽DN膨A状分子窜被细奉胞吸隆收；糕④蔑将混绒合物课快速府转到裕冰浴享中，貌冷却论1~工2沃分，冤参加掘适当惊的培脚养基输，在槐37行踩℃帐培养反45组分，碧使细该胞复鹊苏并疤表达批质粒策所携保带的随转化币基因爸；宽⑤棕通过序选择者培养血基上敬平板史培养龟，选佩择转叉化体循。视⑥振如果珠用抗什菌素印筛选枯转化鄙体，哥作为众对照弟的受版体菌瓶应该菠在此涉培养虏基上欧不生属长。攀〔2蒙〕讲电穿扩孔转委化法视根本权原理粮是利缘用高跑压电较脉冲乒作用横，在淘大肠违杆菌迹细胞杆膜上冷进行绞电穿撤孔〔饲el液ec卵tr评op惕or屿at清io换n粥〕，乓形成爹可逆锯的瞬泪间通参道，骆从而们促进落外源意DN晋A的极有效志吸收荐。唐受体弟细胞坝的准继备：雅当细纽菌生苹长到叫对数稍中期渗后予鼓以冷慨却、哭离心扰，然聋后用棵低盐够缓冲古液充贡分清跑洗降转低细稀胞悬糠浮液响的离束子强轨度，旦并用辆10于%甘午油重拘悬细拼胞，蔬使其努细胞痛浓度沟为3吩×1思01傲0个锣／m低l，诸分装局，在谊干冰迎上速认冻后困置于根-7粮0版℃坊贮存难。每翻小份偿细胞键融解战后即捆可用牵于转休化，钳有效那期达逐6个惧月以奶上。讯〔3盆〕那三亲使本杂米交接肾合转祝化大提肠杆换菌梢原理假：是之基于酒非接帮合型把质粒工的迁仔移作济用〔密mo凑bi僻li描za霉ti格on滴〕而笨建立例的一源种D曲NA山转化亭方式翁。首陆先将式具有皇接合虫转化福功能盆的辅洁助质瓜粒转运移至撇含有由重组斗质粒巡的供匹体细爆胞中织，然冠后将坦这种默供体送细胞皂与受骑体细粗胞进腔行混相合，嘱促使葬两者霉发生涌接合睬转化扎作用桶，将惭重组魄质粒反导入烤受体雷细胞博。整拍个接扔合转劝化过飞程涉种及到眯3种须有关波的细客菌菌符株，谅即待车转化煮的受创体菌眯、含余有要盈转化顷的重塔组质和粒D慕NA劫的供逝体菌套和含民有广匙泛宿笑主的速辅助牵质粒惧的辅淡助菌扇，故砖称三表亲本拜杂交堵接合辉转化循法。虹尤其趟适用单于那饥些难倍以采仪用C冷a办2+羞诱导旬转化遵法或川电穿高孔法柳等进健行重拥组质纹粒D方NA肚分子届直接耗转化容的受皮体菌秩。沈〔4殃〕击转化需率的滩计算学及其颤影响枕因素雨转化昂率是剖指洒DN调A分究子转锐化受医体菌互获得变转化舒子的辟效率扩有两前种表丝示方删式：狐A：回以转携化子姐数与报用于关转化全处理技的D轿NA主分子蝇数或侍质量依的比莫率表善示柳B：仗以转隶化子螺数与吧用于油转化至处理都的受江体细猜胞数众的比迁率表每示。购以用用于转基化处卧理的布受体宋细胞皆数为抗基数级来计唉算转反化率杂A：职通过既菌液画OD胁值测汇定或江细菌饥计数呜，计舍算出筑用于概制备桂感受文态细酬胞的问受体芹菌总链数。辨B：绝计算舟转化灰子与及受体信菌的贪比率地。宋用于泼制备巾感受炎体细咐胞的均菌液仗每毫忘升有颠5×货10碌7个权菌体漏，那么到4丈ml锣菌液菌有2释×1渣08危个菌蜂体，吐由此志菌液貌制备际成感腾受态伯细胞柄，通傅过转怖化处伍理，舍获得耐10即00共个转浇化子好，那么阻转化员率是誉10耽3／右〔2际×1己08仪〕＝晴5×概10崖-耗6。兆其含肤义是断每个亚受体焰菌细主胞被诚转化凳的概麦率是略5×铅10巩-6谁，或味者说饭，要忽得到镇一个蜘转化黑子，以需要栽2×丹10北5个耗受体稻菌细大胞。华每单牲位质颠量的荐DN训A分虎子获薄得的档转化液子数制来表喂示煎单位炮通常偿是转歼化子叹数每链μg占D搏NA程分子颗，如漠每μ浇g重仆组D制NA活分子城获得棋10贸6个柜转化咐子，散那么转首化率担为1积06限个/术μ泄g寻DN休A分辉子。桐影响野转化病率的颜因素源：禾分子筒量雅载体膏类型吸及构推型喝重组李DN牙A分赴子的蚀浓度稠与纯掘度集受体洒细胞汤2.戴鸭重组矛λ噬陈菌体糕DN坚A子原转导城大肠泡杆菌粒小转导叼〔t捷ra闯ns吩du葡ct舒io讲n〕爆是指互通过每λ噬缸菌体袄〔病垦毒〕查颗粒给感染掏宿主器细胞犯的途画径把弃外源渡DN陕A分挠子转校移到雀受体陶细胞林内的坛过程塌。λ猜DN鸭A映与外圣壳蛋致白结枣合成涝噬菌碑体颗肿粒，映才有业转导野宿主惭大肠西杆菌然的能咱力。艘因此火重组巾的哪λD窝NA将必须引进行侍体外群包装哨。限所谓茄体外勿包装座，是针指在漠体外塑模拟渔λ噬伪菌体由DN薯A分狮子在哨受体耐细胞从内发类生的矩一系乔列特圈殊的汤包装挂反响摸过程揉，将浆重组丧λ噬管菌体极DN训A分晒子包解裴为堆成熟挣的具航有感阴染能锄力的救λ噬饰菌体跟颗粒胶的技殖术痰。载乏辞在实代验方决法上泼，体迫外包竟装包弦括两聚个方悬面：念〔1数〕包你装抽所提物弱的制删备；蹈〔2逼〕体查外包塑装过雄程。荒二、韵重组怨DN乡A分鹊子转梯入真矿核细鞠胞忙1.离挺根癌选农杆善菌T卧i质婚粒介炒导法置农杆处菌介喘导的咬Ti扭质粒竟载体证转化膏法是兄目前贩研究般最多种、机鹅制最贱清楚伐、技财术方机法最代成熟发的基截因转投化途嘱径。妈迄今破为止士约8惰09券6的兄转基塔因植电株都招是利睬用农逐杆菌闲介导杀转化棚系统没获得副的。馆农杆票菌是梁一类取土壤惨习居拆菌，屈革兰宇氏染叮色呈扶阴性迅，能伙感染乎双子莫叶植捆物和纹裸子建植物花，而式对绝锦大多胸数单元子叶啊植物钩无侵荡染能犬力。旬植物棋受伤章后，雁伤口口处细亩胞分黄泌大廉量的冈酚类攻化合欣物，锡如乙夕酰丁述香酮暂〔A见S〕的和羟锦基乙三酰丁阔香酮症〔O诞H－葱As泊〕，志它们穷是农筛杆菌阵识别眨敏感越植物蔽的信场号分坛子。绵具有宵趋化走性的报农杆柳菌移斥向这尽些细覆胞，馅并将露其T虏i质您粒上畜的T疫－D遮NA旦的转兰移至雄细胞庭内部称。根诸据这暂一性温质，躁将待稼转移邮的目鸟的基哄因组排入T般i质中粒载栽体，外通过叛农杆洪菌介免导进输人植划物细全胞，闹与染秘色体种DN姐A整财合，联得以和稳定竖维持备或表沃达。骗步骤昂：〔说1〕啄外植晶体选田择与迷预培蜓养南；〔部2〕巧接种树活化棍的农抛杆菌缝工程泪菌尚；〔况3〕狱共培侨养氧；〔吨4〕嚼选择剧培养经；〔汪5〕洲转化食植株耽再生宏2.殿粗高压巩电穿言孔法哑利用裙脉冲座电场浊将D国NA书导入使受体搜细胞别的方茄法叫庙做高疲压电扩穿孔脖法。缸利用荣这种辨方法葛，可冻以将忆DN掩A导雹入动颜、植半物及将细菌葵细胞脸。具敲有简堆单方硬便、咳对细茎胞毒捡性低离以及霞转化察效率框高等佩优点匀。勤〔1州〕辛标准蓝的操事作程玩序—附—将钢高浓观度的后含有羊克隆西基因璃的质走粒D忽NA胞加到达原生史质体乏的悬帝浮液圈中，籍然后云置于烦20遇0～易60婆0V舱／c为m的旱电场威下进迁行电螺脉冲利刺激夜。经圾过如牵此电避穿孔孟处理扇的原绒生质摧体在洋组织回培养漆基中歉培养将1～但2星茧期之朴后，庙选择角已经尸捕获缘了转孔化D针NA纳的细婆胞，裕作进塔一步凝的继概续培刻养，望以便规获得扣再生功植株陕。决应用凑这种踩方法疏已成刺功地倚转化牛了玉如米和津水稻共的原沉生质划体，伍其转狱化效装率在龙0．舌1％程～1墓．0槐％之赌间。漂〔2子〕驻影响抽电穿蚕孔导毛入D补NA薪效率搞的因态素：鞭①惯外加堂电场泰的强绍度：激25狂0～兴75悄0缠V／迈cm愧较宜知；抱②丸电脉霸冲的梳时间希：2没0～读10长0m新s；殊③虾工作全温度闻：对概不同古类型参细胞往所要完求的郊条件没不同颗，可戏以在贞0帅℃逃至室胆温〔对25将℃鼠〕之巾间进查行选桑择；荡融④雄DN特A的舰构象丑和浓箩度：碍线性逮D局NA涝比环草状厘DN贫A要仍好，稳浓度卫控制商在1六～床40侄μ利g／业mL概。魔⑤奉工作朴缓冲脸液的慨离子辣成分滩：也嗓对其系DN地A导卧入效荣率发芦生作兽用，作一般鹅用盐尖溶液楼悬浮防细胞沙要比喂用非吃离子膀溶液返更易像DN嚷A的希导入惨。序3.讨待聚乙汉二醇龙介导避的原塌生质议体转致化法竿这种怎方法胖常用索于转皂化酵处母细盯胞以董及其四他真削菌细自胞。漠活泼歇生长集的细脊胞或抢菌丝别体用谊消化黑细胞症壁的修酶处牛理变雹成球沉形体增后，席在适敢当浓悬度的去聚乙罩二醇奋60庄00约〔P吗EG笋－6成00伤0〕伍的介范导下嫂，将乎外源蚀DN罚A转闷化入罢受体救细胞圾中。省4.直寸磷酸老钙或搂DE润AE凡一葡绕聚糖保介导载的转待染子这是按将外怕源基现因导惜入哺钢乳类着细胞棕中进城行瞬晚时表酸达的裳常规水方法脂。疾将被仪转染豪的D垃NA早同正困在溶猎液中具形成屑的磷港酸钙允微粒攻共沉尼淀后敌通过姻内吞客作用丹进入伟受体兴细胞帆。对肿于D归EA魂E-葛葡聚袄糖作惊用的锯机理晕尚不雷清楚顽，可浑能是汪其与然DN楚A结饥合从梦而抑胜制核斧酸酶斯的作陶用或妨与细岛胞结践合从俘而促嫩进D殿NA容的内斤吞作标用。罩5.跪匹原生蜡质体舱融合爷通过疗带有伍多拷花贝重骑组质挎粒的绩细菌屡原生抗质体钱同培衰养的鉴哺乳蚀细胞韵直接睁融合把。经缺过细惯胞膜卸融合划，细德菌内苹容物倒转入罚动物伟细胞傻质中偷，质烧粒D血NA鸣被转摧移到任细胞鼓核中吃。奸6.草雪脂质府体法皱将D藏NA危或R铸NA玩包裹愚于脂帆质体樱内，遵然后翻进行叛脂质维体与捐细胞殃膜融醋合将羊基因数导入摇。育脂质港体是江由磷奏脂组畜成的画膜状弱结构补，用热它包笛装外新源D舞NA敏分子绵，然米后与让植物贤原生摘质体傻共保快温。智于是跟脂质芹体与申原生睬质体词膜结公构之嫩间发姿生相抬互作宿用，除此后手通过持细胞捞的内伤吞作枕用而坡将外膊源D共NA应高效像地纳坦入植迈物的附原生叛质体壁。阀这种案方法霸具有暂多方轿面的搬优点题，包威括可颂保护立DN推A在攻导入匠细胞赌之前剥免受犹核酸互酶的庄降解此作用药，降路低了肾对细顽胞的刘毒性诊效应界，适店用的廉植物玻种类海广泛距，重岔复性却高，惯包装午在脂涌质体奶内的偏DN铺A可赞稳定材地贮餐藏等子。用否此法赢转化且水稻赴原生誓质体扭的效消率可掏达1校4％仅，并涝得到畏了转骄基因拍的再辽生植狠株。比7.遣搅显微陕注射斜法沙借助事显微心镜将于外源即DN知A直尤接注朱射到羡受体慎细胞交的方逃法。键适用恼于此漏种方默法的五植物圆样品校包括亿原生借质体极、游蹈离的割细胞著，以颂及诸渡如愈散伤组句织、请分生展组织剩和胚棋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