酶的人工模拟课件

关于酶的人工模拟第1页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三一、模拟酶的理论基础和策略

酶是高效的催化剂，它的应用日趋广泛。由于酶容易受到多种物理、化学因素的影响而变性失活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂。模拟酶是人工合成的高分子化合物，它模拟酶的结构和催化特性，并且能耐较恶劣的环境，活性稳定而持久。

1.模拟酶的概念第2页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三研制模拟酶的基础

20世纪70年代以来，由于对蛋白质结晶学、X射线衍射技术及光谱技术的发展，人们对许多酶的结构有了较深入的了解，对酶的结构及其作用机理能够在分子水平上作出解释。动力学方法的发展以及对酶活性中心、酶抑制剂复合物和催化反应过渡态等结构的描述，促进了对酶作用机制的研究，从而为人工模拟酶的发展提供了理论基础。

第3页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三模拟酶的概念

模拟酶就是根据对酶催化作用起主导作用的因素，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及微环境等结构特征，以及酶作用机理和立体化学特性，以这些分子作为模型来模拟酶对其底物的结合和催化过程，以求模拟酶保留酶的高效性和专一性，克服其稳定性差等缺点。第4页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三“主－客体”化学

Pederson和Cram报道了一系列光学活性冠醚的合成方法。这些冠醚可以作为主体而与伯铵盐客体形成复合物。Cram把主体与客体通过配位键或其他次级键形成稳定复合物的化学领域称为“主－客体”化学（host-guestchemistry）。主－客体化学的基本意义来源于酶与底物的相互作用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补，这种主－客体互补与酶和它的底物结合情况相似。

第5页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三超分子化学

另一位法国的著名科学家Lehn也在这方面作出了非凡的贡献，他在研究穴醚及大环化合物与配体络合过程中，提出了超分子化学（supermolecularchemistry）的概念，并在此理论指导下，合成了更为复杂的主体分子。他提出，超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键的作用。当受体与络合离子或分子结合成具有稳定结构和性质的实体，即形成了“超分子”，它兼具分子识别、催化和选择性输出的功能。第6页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三1987年诺贝尔化学奖获得者

由于Cram、Pederson和Lehn在合成与天然蛋白质功能一样的有机化合物方面取得了开拓性成果，他们获得了1987年的诺贝尔化学奖。CramPedersonLehn第7页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三模拟酶设计的前提

在设计模拟酶之前，应当对酶的结构和酶学性质有深入的了解：①酶活性中心－底物复合物的结构；②酶的专一性及其与底物结合的方式与能力；③反应的动力学及各中间物的知识。第8页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三模拟酶设计时应考虑的因素

设计模拟酶时应考虑如下因素：非共价键相互作用是生物酶柔韧性、可变性和专一性的基础，故模拟酶应为底物提供良好的微环境，便于底物、特别是反应的过渡态中间物以离子键、氢键等结合；催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的反应基团接近，以促使反应定向发生；模拟酶应有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性。

第9页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三二、模拟酶的分类模拟酶可分为：①

主－客体酶模型，包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等；②

胶束酶模型；③

肽酶；④

抗体酶；⑤

分子印迹酶；⑥

半合成酶；⑦

杂合酶；⑧

进化酶。

第10页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三1．主－客体酶模型

环糊精（cyclodextrin，CD）是由多个葡萄糖以α－1,4－糖苷键连接而成的一类环状低聚糖，可以含有6、7、8个葡萄糖单位。它们均是略呈锥形的圆筒，其伯羟基和仲羟基分别位于圆筒较小和较大的开口端。这样，CD分子外侧是亲水的，其羟基可与多种客体形成氢键；其内侧是C3、C5上的氢原子和糖苷氧原子组成的空腔，这个空腔具有疏水性，能够包接多种客体分子，类似于酶对底物的结合。在CD分子的两面引入催化基团，就可能具有酶的结合底物和催化反应的作用。

（1）环糊精酶模型第11页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三环糊精的结构第12页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三A．水解酶的模拟α－胰凝乳蛋白酶是一种蛋白水解酶。它的活性部位有His的咪唑基、Asp的羧基及Ser的羟基组成电荷中继系统，参与催化底物的水解反应。Bender等在环糊精上引入这三种基团，成功地制备出了模拟酶β－Benzyme（图中的A），此酶催化对叔丁基苯基乙酸酯水解比天然酶快一倍以上。Rama等人将咪唑基的N直接与CD的C3相连，所得的模拟酶（图中的B）催化对叔丁基苯基乙酸酯水解比天然酶快一个数量级。

第13页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三以环糊精为主体的模拟水解酶ABC第14页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三水解酶的模拟

Breslow在环糊精模拟酶领域做了大量而出色的工作，他认为模拟酶增加催化效率的关键是要增加环糊精对底物过渡态的结合能力，最简单的办法是修饰底物来增加底物同CD的结合，从而可能增加CD对底物过渡态的结合，他们设计了一系列以二茂铁、金刚烷为结合位点的硝基苯酯（图中的C），以CD为催化剂可以加速这些酯水解达105－106倍。

第15页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三B．核糖核酸酶的模拟

核糖核酸酶有2个His咪唑基及1个质子化的赖氨酸氨基处于活性中心，这2个咪唑基在催化反应中交替起着广义酸碱的作用。Breslow等人设计合成了两种环糊精A和B模拟酶来催化环状磷酸二酯的水解，A催化Ⅰ生成Ⅱ，而B催化Ⅰ生成Ⅲ。这里环糊精底物复合物的几何形状和催化基团的位置对被水解键的选择性起了决定性的作用。这两种模拟酶的最适pH都在6左右，说明这两个咪唑基也是分别以广义酸碱参与催化的，与天然酶的催化机理一致。

第16页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三以环糊精为主体的模拟核糖核酸酶第17页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三C．转氨酶的模拟

磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是许多涉及氨基酸反应的辅酶，其中最重要的是转氨酶催化的转氨反应。吡哆醛本身也有催化此反应的作用，但由于它本身无底物结合部位，反应速度远不如转氨酶催化时快。在环糊精上连接吡哆胺（A），它催化苯并咪唑基酮酸转氨基的速度比吡哆胺单独催化时快200倍，产物中D型和L型异构体的含量不同，说明该模拟酶具有一定的立体选择性。Tabushi等将催化基团乙二胺引入吡哆胺基环糊精（B），使得反应加速了2000倍以上。

第18页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三以环糊精为主体的模拟转氨酶第19页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三D．含核糖的环糊精酶模型

Han等合成了一系列含核糖的环糊精酶模型，它兼具核酸酶、连接酶、磷酸酯酶和磷酸化酶的活性。核糖中的邻二羟基对催化起着关键的作用。R0R1R3R12第20页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三E．桥联环糊精酶模型

桥联CD是近年发展起来的一类新型酶模型，它的两个CD及桥基上的功能基构成了具有协同包接和多重识别功能的催化活性中心，能更好地模拟酶对底物的识别和催化作用。Matsui等将乙二胺偶联到CD上，然后与铜盐作用形成桥联环糊精，它催化糠偶姻氧化成糠偶酰的反应，比没有催化剂时大20倍。图中A的两个CD协同包接糠偶姻的两个呋喃环，同时糠偶姻的烯醇负离子通过与桥基铜离子的静电或配位作用得以稳定，从而加速了反应。第21页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三桥联

CD酶模型第22页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三桥联CD水解酶模型

Breslow近年来在桥联CD方面做了较多工作，不仅报道了一系列桥联CD的合成方法及其疏水结合能力，还成功地将图中的C用于催化双疏水基酯的水解反应。底物被两个CD包接后，配位于桥基的Cu2+正好处于底物的酯基附近，有利于OH－对酯基的进攻。其催化速率比无催化剂时提高了2.2×105倍。第23页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三桥联CD胡萝卜素氧化酶模型

French等合成了含卟啉的桥联CD，它可以选择性地氧化C15=C15’键。他们的设计思路是：①合成的桥联CD对底物胡萝卜素的结合远大于对产物视黄醛的结合，这样避免了产物抑制；②引入能催化双键反应的金属卟啉作为活性中心。第24页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三桥联CD胡萝卜素氧化酶模型胡萝卜素视黄醛第25页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三四桥联CD酶模型

细胞色素是一类含血红素辅基的电子传递蛋白质的总称，它们参与氧化还原反应。Breslow等合成的四桥联环糊精模拟P-450酶模型，是将P-450酶活性中心的金属卟啉分子与4个环糊精分子相连，构成了既具有底物结合部位又有催化基团的小分子酶模型。

第26页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三四桥联环糊精模拟P-450酶模型第27页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三底物的修饰

为了使该模拟酶催化甾体分子的羟基化，先给底物引入能与环糊精特异结合的叔丁基苯。在四桥联环糊精模拟P-450酶模型催化下，此底物能被亚碘酰基苯（PhIO）氧化，在C6位羟基化。此反应表现出相当高的立体特异性。

在C6位羟基上引入第3个叔丁基苯，这样3个叔丁基苯与酶模型中的3个环糊精形成3点结合复合物，可以催化甾体C9位氧化成羟基。由于羟基化后的甾体可转化成重要的药物中间体，因此该酶模型具有很大的应用潜力。第28页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三四桥联CD

模拟酶催化的甾体羟基化反应第29页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（二）合成的主－客体酶模型

除了使用天然存在的主体来构建模拟酶外，人们还合成了冠醚、穴醚、环番、杯芳烃等大环多齿化合物来构建酶模型。

冠醚穴醚杯芳烃

第30页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三环番和杯芳烃的结构特点

环番（cyclophane）和杯芳烃（calixarene）是一类具有共同的结构和功能特征的芳香主体化合物，它们通常拥有两个或两个以上的芳香环，通过亚甲基或醚氧链连接成空间的环状结构，由芳香环构成的疏水空腔具有适当的尺寸，可以与另外一些小分子通过非共价键结合。为了使这类芳香主体化合物在水溶液中具有一定的溶解度，一般在其外层引入一些亲水性基团。第31页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三三种不同大小的杯芳烃杯（4）芳烃杯（6）芳烃杯（8）芳烃第32页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯（6）芳烃的杯状结构第33页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯芳烃与C60的包合物的直接观察

第34页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三环番结构式第35页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三以冠醚为主体的模拟酶

日本学者Koga等采用冠醚为主体，合成了带有巯基的仿酶模型，利用此酶可在分子内实行“准双分子反应”以合成多肽。此模型具有结合两个氨基酸的能力。第36页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三以冠醚为主体的模拟酶

Lehn等人合成了一种优异的穴状配体24－冠－N6O2。它能利用静电引力和氢键结合多聚磷酸阴离子。研究表明此模拟酶在pH2.5～8.5之间可明显水解ATP生成ADP或AMP，在催化过程中形成磷酰胺中间体。在pH7时可加速ATP水解500倍。第37页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯芳烃作为催化剂的优点

在第一代和第二代超分子化合物中，冠醚在溶液中通常表现为环状结构，而不是穴状结构，不能为底物提供有效的结合空腔；环糊精是一类半天然产物，其空腔骨架过于刚性，对底物的结合能力受到一定限制。杯芳烃是完全通过实验室合成的大环化合物，与冠醚和环糊精相比具有内在优势：其疏水的空穴可通过简单地改变单元数目而调节尺寸、构象易变并可受到调控、边缘可以引入功能基团进行修饰和衍生化。因此，杯芳烃及其衍生物已经被成功地用作催化剂和模拟酶。第38页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯芳烃的催化活性举例

Taniguchi和Nomura研究了杯芳烃159对苯酚与二氯甲烷的Willimson成醚反应的催化作用，在催化剂存在的情况下，反应24小时后转化率为100%，而没有催化剂时的转化率仅有0.3%。

杯芳烃159叔丁基第39页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯芳烃159催化的Wiilimson成醚反应第40页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三酶催化1-苄基-1,4-二氢烟酰胺的加水反应

酶催化1-苄基-1,4-二氢烟酰胺的加水反应如下，酶为底物提供质子，同时以带负电荷的基团稳定生成的正电荷中间体。第41页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯芳烃模拟酶

杯芳烃162下端的羧基可以为此反应提供质子，上端的磺酸负离子稳定正电荷中间体，从而使第一步（限速步骤）加快而催化反应。杯芳烃163也能加速上述反应，但比杯芳烃162效果差，可能是因为羧酸与磺酸相比不易形成负离子，对正电荷的稳定作用较差。

第42页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯芳烃季铵盐164的水解酶活性

杯芳烃季铵盐164能催化十二烷基对硝基苯酯的水解。杯芳烃季铵盐164对乙酸酯的甲醇解在没有金属离子存在时反应极慢，但加入少量Ba2+后可以使反应加速一百万倍以上，效率已与转酰化酶相当。其原因是主－客体配合物中的Ba2+能稳定亲核加成时产生的负离子中间体。使亲核加成限速步骤的反应速率显著提高。

第43页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯芳烃165的水解酶活性

杯芳烃165在被Ba2+活化后，在中等强度的碱性条件下能作为有效的酰化转移催化剂，它可使对硝基苯基乙酸酯（pNPOAc）的水解速度增加10倍。

第44页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三核酸模拟酶

Reinhoudt等合成了一系列吡啶基修饰的杯[4]芳烃锌配合物（166）和咪唑基修饰的杯[4]芳烃铜配合物（167），将它们作为核酸模拟酶。这些化合物在合适的pH下可以显著催化RNA模型底物2-羟基丙基-对硝基苯基磷酸二酯的环化反应，其中166使反应加速2300倍，167使反应加速10000倍，大于所有其他核酸模拟酶对该底物的催化活性。第45页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯芳烃166和167的结构式第46页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三杯芳烃166和167的催化机理第47页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三2．胶束模拟酶胶束的结构

球状板层状圆柱状第48页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三模拟水解酶的胶束酶模型

在水溶液中，酶分子中有疏水的微环境，模拟酶在这种微环境中的化学反应的特殊性质，也是模拟酶的一个重要方面。有人利用组氨酸的衍生物十四酰组氨酸与十六烷基－三甲基溴化铵组成两种分子的混合微胶束，来催化乙酸对硝基苯酯的水解，其速率比用组氨酸催化增加了100倍。

第49页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三氧肟酸和肟在胶束模拟酶中的作用

在胶束模拟酶中常用氧肟酸和肟代替羟基来研究氧负离子的亲核反应。它们催化乙酸对硝基苯酯水解的速度常数比在非胶束中提高近万倍。如用氧肟酸与十六烷基三甲基溴化铵一起催化酮醇的去质子反应，其反应速度提高3000～20000倍，是OH－催化的60～300倍。

肟氧肟酸第50页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（2）辅酶的胶束酶模型

将疏水性维生素B6长链衍生物与阳离子胶束混合，在形成的体系中加入Cu2+，可将酮酸转化为氨基酸，有效地模拟了以维生素B6为辅酶的转氨基作用。吡哆醛的长链衍生物可以使丝氨酸和吲哚合成色氨酸。第51页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（3）金属胶束酶模型

金属胶束是指带疏水基团的金属配合物单独或与其他表面活性剂共同形成的胶束体系。其作用是模拟金属酶的活性中心和疏水性的微环境。这种体系目前已经取得了引人注目的成绩，特别是在模拟羧肽酶A、碱性磷酸酶、氧化酶、转氨酶等方面取得了很大的成功。将金属酶的简单模型引入胶束体系，利用金属离子的特殊作用催化水解反应，而胶束所具有的疏水性微环境则对底物起包接作用。

第52页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三金属胶束水解酶

Tonellato等人以α－吡啶甲酸对硝基苯酯（PNPP）为底物，研究了不同表面活性剂配体在Cu2+或Zn2+存在时催化PNPP水解的能力，发现Cu2+、Zn2+的存在可使PNPP的水解速度显著增大，当Cu2+与相应的表面活性剂形成1:1配合物时，水解反应速度达到最大。

第53页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三3．肽酶

肽酶（pepzyme）是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。根据化学和晶体图像数据提供的主要活性部位氨基酸残基的序列位置和分隔距离，将构成酶活性部位的残基以适当的空间位置和取向通过肽键相连，而分隔距离则用无侧链取代的甘氨酸或半胱氨酸调节。第54页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三模拟蛋白酶的肽酶

Atassi和Manshouri设计合成的两个29肽ChPepz和TrPepz分别模拟了α－胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的活性部位，二者水解蛋白的活性分别与其模拟的酶相同。在水解2个或2个以上串联的赖氨酸和精氨酸残基的肽键时TrPepz比胰蛋白酶的活性更强。对于苯甲酰酪氨酸乙酯的水解，ChPepz比α－胰凝乳蛋白酶的活性稍低，而TrPepz则无活性。对于对甲苯磺酰精氨酸甲酯的水解，TrPepz比胰蛋白酶的活性稍低，而ChPepz则无活性。

第55页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三4．半合成酶

半合成酶是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。

Bender等首次成功地将枯草杆菌蛋白酶活性部位的丝氨酸残基，经苯甲基磺酰氟特异性活化后，再用巯基化合物取代，将丝氨酸转化为半胱氨酸。虽然产生的巯基化枯草杆菌蛋白酶对肽或酯没有水解活性，但能水解高度活化的底物（如硝基苯酯等）。

第56页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三半合成酶

Hilvert等利用类似的方法，将枯草杆菌蛋白酶结合部位的特异性Ser转变为硒代半胱氨酸，此硒化枯草杆菌蛋白酶既表现出转氨酶活性，又表现出含硒谷胱甘肽过氧化物酶的活性。利用半合成酶的方法不但可以制造新酶，还可以获得关于蛋白质结构和催化活性间关系的详细信息，为构建高效人工酶打下基础。

第57页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三三、抗体酶1．抗体酶的原理及发展简述尽管科学家们在模拟酶方面作了大量的工作，但人工合成的模拟酶仍然与天然酶的催化效率相差很远，并且反应类型也极为有限，多数为水解酶的模拟。由于逐渐认识到催化过程中关键的一步是酶与底物过渡态中间物的紧密结合，联想到抗原导致生物体内抗体的合成以及抗原抗体的紧密结合，如果用某些人工合成的小分子底物过渡态中间物的类似物作为半抗原，诱导生物体合成相应的抗体，这种抗体可能会有催化该小分子底物发生反应的活性。并将这种生物催化剂称为抗体酶(abzyme)。

第58页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶的特点

抗体酶技术是化学和生物学的研究成果在分子水平交叉渗透的产物，是抗体的极其多样性和酶分子的巨大催化能力结合在一起的蛋白质分子设计的新方法。构制抗体酶的目的在于拓宽酶催化的应用范围，产生能催化生物体内不存在的反应的酶。

第59页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶研制的历史

1946年，LinusPauling阐明了酶催化的实质，同时指出，稳定的反应过渡态类似物可以竞争性地抑制酶活性。酶之所以具有催化活力，是因为它和反应物的过渡态（底物激态）发生特异性结合，而不是与反应的底物基态发生特异性结合。

第60页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶研制的历史

酶产生的生物局限性是酶催化高效性无法普遍化的限制因素，突破限制就能人为地控制酶的产生。高等动物的免疫系统为我们提供了可以利用的工具。1969年，Jencks提出通过免疫诱导产生抗底物激态的抗体，该抗体具有类似酶的催化活性。这个抗体酶设想的提出，有可能为任何一个化学反应构制一个专一性的酶。

第61页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶研制的历史

在抗体酶研制中主要遇到两个问题：①底物激态瞬间存在，无法提取。根据竞争性抑制现象，可以通过化学方法合成底物过渡态的稳定性类似物作为半抗原；②抗原在分子量上有一定的要求。由于抗原决定簇的多样性，得到的抗体是多克隆的，其中真正需要的抗体酶含量小。1975年，Kohler和Milstein发明了单克隆技术，使抗体酶的获得成为可能。

第62页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶研制的历史

还可以将能与底物结合的无酶活性的抗体通过人工的方法引入催化基团，使之变成有催化活性的抗体酶。目前已经构制了催化酰基转移反应、酯水解和酰胺水解反应、氧化还原反应、光诱导聚合和光裂解反应、金属螯合反应、重排反应的抗体酶。

第63页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三2．抗体酶的制备方法（1）稳定过渡态法迄今为止，大多数抗体酶是通过理论设计合适的、与反应过渡态中间物结构类似的稳定化合物作为半抗原，免疫动物后产生针对此半抗原的抗体来获得。

第64页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶举例

Shultz小组利用与底物扭曲构象相似的扭曲卟啉作半抗原，制备的抗体可催化卟啉金属螯合反应。亚铁螯合酶是血红素生物合成途径中的末端酶，可催化亚铁离子插入到原卟啉中。N－甲基原卟啉由于内部甲基取代而呈扭曲结构，它是此酶的有效抑制剂，也与酶催化的卟啉金属螯合反应的过渡态中间物结构类似。由于甲基卟啉的抗体可催化平面结构原卟啉的金属螯合反应，这也证明了该反应存在扭曲的过渡态中间物。

第65页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三亚铁螯合抗体酶的诱导物过渡态类似物

底物

产物

第66页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶举例

Napper等用一个环化的磷酸酯作为底物过渡态类似物，使动物免疫得到单克隆抗体24B11，发现该抗体可催化外消旋的羟基羧酸酯分子内环化形成内酯，使反应加速167倍，而且首次观察到抗体酶催化反应的专一性。反应产物中一种对映体的含量比另一种高出94%。

第67页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三磷酸内酯抗体酶的诱导物第68页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（2）抗体与半抗原互补法

抗体与其抗原的相互作用是相当精确的，抗体常含有与抗原结合的特异功能基团。带正电荷的抗原常能诱导出结合部位带负电荷的抗体，反之亦然。利用这个特点，可在抗体的抗原结合部位引入特定的带电荷基团作为催化基团。

第69页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶举例

Shokat等利用抗体与半抗原之间的电荷互补性，用带正电荷的半抗原（H1）制备抗体，此抗体能催化β－消除反应。其中一株单克隆抗体43D4－3D3可加速反应105倍。分析其反应动力学发现，kcat为pH依赖性的，通过滴定证明这个位于抗原结合部位的可解离基团的pKa值为6.2，是抗原结合部位的谷氨酸γ羧基。在疏水环境中谷氨酸侧链羧基的酸性减弱，一般以碱的形式起催化作用。

第70页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三β－消除抗体酶的诱导物H1第71页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（3）熵阱法

另一种设计半抗原的方法是利用抗体结合能克服反应熵垒。抗体结合能被用来冻结转动和翻转自由度，这种自由度的限制是形成活化复合物所必需的。

第72页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶举例

用抗体作为熵阱非常成功的例子是抗体催化的狄尔斯－阿德耳（Diels-Alder反应）。Diels-Alder环加成反应是众多形成C－C键反应中的一种，是需要经过高度有序及熵不利的过渡态的反应。

Hilvert等用稳定的三环状半抗原诱导的抗体可催化起始加合物的生成，然后立即排出SO2，产生二氢苯邻二甲酰亚胺。

第73页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三环加成抗体酶的诱导物第74页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶举例

Jackson等合成一个有椅式构象的氧杂双环化合物来模拟由分支酸生成预苯酸这样一个克莱森重排反应的过渡态结构，用此双环半抗原诱导的抗体催化，可使重排反应加速104倍。

分支酸预苯酸第75页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（4）多底物类似法

很多酶的催化作用要有辅因子参与，这些辅因子包括金属离子、血红素、各种维生素辅酶等，因此，将辅因子引入到抗体结合部位将会大大地扩大抗体催化的范围。用多底物类似物对动物进行一次免疫，可产生既有辅因子结合部位，又有底物结合部位的抗体。小心设计半抗原可确保辅因子和底物的正确定向。

第76页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶举例

将三亚乙基四胺Co（三价）连接到肽底物上作为半抗原，使动物免疫后产生抗体。此抗体的结合部位能与肽底物、三亚乙基四胺及Zn2+结合，Zn2+的开放配位部位可将OH－传递到底物的待水解肽键的羰基碳上，促进肽键水解，可加速反应105倍。第77页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（5）抗体结合部位修饰法

通过对抗体的修饰，在抗体的抗原结合部位引入催化基团是增加催化效率的又一途径，引入功能基团的方法一般有两种，即选择性化学修饰法和基因工程定点突变法。亲和标记是将催化基团引入到抗体结合部位的有效方法。一般先用可裂解亲和试剂与抗体作用，然后再用二硫苏糖醇处理，在抗体的结合部位附近引入巯基，用此巯基作为锚可以很方便地引入其他化学功能基团（如咪唑）。第78页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶举例

吉林大学罗贵民教授领导的研究小组开发了一种用单克隆抗体制备含硒抗体酶的方法。抗体可变区一般含有数个丝氨酸残基，而丝氨酸的羟基可用苯甲磺酰氟活化，再经硒化氢处理后，转变成硒代半胱氨酸，而硒代半胱氨酸是谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性中心的催化基团。他们用谷胱甘肽二硝基酚（GSH－DNP）及其甲酯、乙酯分别作为半抗原得到抗体，再用上述方法引入硒代半胱氨酸，得到的抗体酶分别为天然兔肝GPX活性的1/5、1.6倍和8.5倍。

第79页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三谷胱甘肽过氧化物抗体酶结构与功能的关系

这些结果说明，3种含硒抗体酶活性不同的主要原因与抗体活性中心的空间结构有关，半抗原的结构不同，产生的抗体活性部位的结构必定不同。调节半抗原的结构，实际上是在调整抗体活性部位的空间结构，使其中的催化基团处于更有利于发挥催化作用的微环境中，因而能产生活性高于天然酶的抗体酶。通过基因工程的方法，在抗体的结合部位引入催化氨基酸残基，也能大大提高抗体酶的活性。

第80页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体的抗原结合部位引入催化基团的方法第81页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（6）抗体库法

抗体库法即用基因克隆技术将全套抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段Fab，从中筛选出特异性的可变区基因。从抗体库中可用各种抗原筛选出相应的抗体基因。若用底物过渡态类似物作抗原，可筛选出有催化活性的抗体基因。将筛选出的克隆大量培养，可得到大量的抗体酶。第82页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三3．提高抗体酶催化活性的因素（1）抗体酶的结构

1969年，Pattern等在用底物过渡态类似物膦酸硝基苯酯作为半抗原，免疫动物产生催化酯水解的抗体酶的研究中发现，在免疫过程中发生了体细胞突变，有9个碱基发生了突变。因突变引起的抗体结构变化为半抗原创造了一个良好的结合区，使抗原抗体之间的亲和力增加了14000倍，抗体的催化活性也因此提高了100倍。这一重要发现表明，选择对抗原具有较高亲和力的抗体酶，其催化活性也会提高。因此，可用更长时间免疫或直接通过诱变的方法来提高抗体酶的亲和力，从而提高其催化活性。第83页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（2）半抗原与载体蛋白的偶联方式

半抗原与载体蛋白之间的臂长和偶联方式都会影响抗体酶的活性。偶联方式不同，所得的抗原价（半抗原密度）不同，会影响抗原的免疫原性。载体蛋白与半抗原的不同基团偶联产生的抗体酶，活性也会有显著差异。Landry等通过载体蛋白与半抗原不同基团的偶联，合成了3种抗原，经免疫动物获得了9种单克隆抗体。研究表明，这3种抗原产生的抗体酶催化活力显著不同。

第84页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（3）异源免疫

Suga等在研究催化酯水解的抗体酶时发现，在抗体结合区的适当位置上存在酸性和碱性两种氨基酸残基，能提高其催化效率。用化学合成的方法，合成两性离子抗原比较困难。为此，1995年，Tsumuraya设计了异源免疫的新方法：由结构相关的不同抗原依次免疫动物，由此产生的抗体可能对两个半抗原均有亲和力。第85页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三异源免疫

若采用一对分别带有正负电荷的半抗原进行异源免疫，则可能在抗体结合区产生酸碱催化残基。他们用带正电荷的季胺盐半抗原和带负电荷的膦酸酰胺半抗原异源免疫产生的抗体酶的活性，比用单一半抗原同源免疫产生的抗体酶提高了100倍。

第86页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三（4）反应免疫

反应免疫是最近由Laner研究小组提出的新概念。它是指免疫原具有高度反应性，在反应过程中，抗原在抗体的结合区发生化学反应，从而影响抗体结构和催化特性，扩大抗体酶的适用范围。如膦酸二酯半抗原在免疫过程中失掉一个膦酸酯，变成单酯半抗原，由此产生的抗体将是针对两个抗原交叉反应而获得的，与两个抗原均有亲和力。由反应免疫所产生的催化抗体，就可能会催化多底物反应，提高催化效率。

第87页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三抗体酶的特点

和人工合成的简单模拟酶相比，抗体酶主要有以下几方面的改进：①所催化的反应类型更为广泛；②抗体酶表现一定程度的底物专一性；③催化效率与简单模拟酶相比也有大大提高，但多数仍未达到天然酶的水平。

第88页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三研制抗体酶的困难

限制抗体酶研究和应用的主要因素是反应过渡态的确定。目前，许多反应历程还不清楚，从而无法设计过渡态底物的稳定类似物，因此，对各种反应历程的研究成为抗体酶发展的“瓶颈”。而在反应历程的研究中，抗体酶方法又将在其中发挥重要作用，可以通过构制预期的抗体酶来验证反应历程，使理论上的历程更接近实际。

第89页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三研制抗体酶的困难

抗体酶还未达到最大限度应用的原因在于抗体酶的提取和工业化生产还未成熟，抗体酶催化活性较低。人们虽然注意到了酶与底物中间态的紧密结合，但对酶催化的其他重要因素仍然没有搞得太清楚，提高抗体酶催化活性的方法还处在实验阶段。相信在对酶作用机制进一步深入了解的基础上，在抗体酶的固定化已取得成功的基础上，抗体酶的研究必将有新的发展而逐渐达到天然酶的水平。

第90页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三四、分子印迹酶

分子印迹（molecularimprinting）是制备对某一种特定分子（印迹分子）具有选择性结合能力的聚合物的过程。制备过程一般包括：①选择好印迹分子；②选择好单体，让其与印迹分子互相作用，并在印迹分子周围聚合成聚合物；③将印迹分子从聚合物中除去(采用抽提法)。这样在聚合物中就形成了与印迹分子形状相同的空穴，可以与印迹分子特异地结合。如果选择的印迹分子是某种酶作用的底物，此聚合物就可能是一种印迹酶。第91页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三分子印迹原理图印迹分子第92页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三分子印迹酶举例

Mosbach等人分别以天冬氨酸和苯丙氨酸两种单体的1:1混合物，及其产物天苯二肽为印迹分子，以甲基丙烯酸甲酯为单体，以二亚乙基甲基丙烯酸甲酯为交联剂，聚合得到具有催化二肽合成能力的二肽合成酶的分子印迹酶。以产物为印迹分子得到的分子印迹酶活性较高，在反应进行48小时后，二肽产率达到了63%，而以两种氨基酸单体的混合物为印迹分子得到的分子印迹酶产率较低。第93页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三过渡态类似物甲膦酸对硝基苯酯作印迹分子第94页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三Wulff的分子印迹酶模型印迹分子底物引入脒基作为催化基团催化底物水解第95页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三分子印迹用于拆分手性化合物

利用手性化合物之一作为印迹分子，制作的分子印迹可作为层析介质，用于拆分不同构型的分子。

（EDMA:交联剂乙二醇二甲丙烯酸酯）聚合单体丙烯酸印迹分子L-苯丙氨酰苯胺第96页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三生物印迹酶

在水相介质中被印迹分子诱导的酶或非酶蛋白会产生“记忆”效应。如果将在水相中被印迹分子诱导而发生构象变化的蛋白质冰冻干燥，然后将其置于非水介质中，蛋白质将保持被诱导后的构象。如果所用印迹分子是酶的底物、竞争性抑制剂或底物的过渡态类似物，则此生物印迹蛋白可能表现出酶的活性。称为生物印迹酶。生物印迹酶只能在非水介质中催化反应，如果将生物印迹酶放到水介质中，则其诱导后的构象不能保持，失去催化能力。第97页，讲稿共108页，2023年5月2日，星期三非水相生物印迹酶

水溶性脂肪酶在通常情况下是非活性的，其底物结合部位有一个“盖子”，当底物脂肪以脂质体形式接近酶时，盖子打开，脂肪的一端与底物结合部位结合。为了获得高效非水相催化的脂肪酶，Braco等将适当的两亲性表面活性剂与酶印迹，待表面活性剂分