Cytiva：层析介质寿命和清洁验证综合设计的良好实践白皮书

2清洁和保存验证的综合设计4的开发4清洁工艺的放大7的寿命和清洁验证7层析介质寿命验证的设计8层析介质缩小模型的清洁验证的设计11层析介质寿命和清洁验证综合设计案例13层析介质商业化规模的清洁验证14商业化规模清洁验证案例15持续监控和维持16166散装条件下的层析介质保存验证17装柱条件下的层析介质保存验证17生产工艺的预防步骤181920合格的供应商具有充实的研究数据20污染物控制的数据21结论23缩略语23参考文献24在整个生物药物生产工艺中，层析介质是至关重要的原材料。层析介质对于实现生物制品的纯度、有效性以及安全性都非常重要，需要对其进行足够的控制以实现工艺性对于生物药物工艺，大多数时候层析介质是特定于专用产品使用，但通常会选择多循环次数使用。从工艺经济性角度，如果能够使用层析介质至一定的循环次数，再使用层析介质的多循环使用使得在生物药物的注册审评以及常规的生产检查中，层析介质FDA人用单克隆抗体产品的生产和分析考用重组单克隆抗体制品总论”中也提到需要验证纯化用材料(如色谱柱介质)的重复适尽管众多法规对层析介质的寿命、清洁和保存都提出了要求，但近几年的FDA483表格还是有不少针对层析介质验证的审查评论(表1-1)[4]。层析介质验证的问题在各种会议上持续的被讨论，以及在监管机构的许可审评和常规检查中不断的被质疑，这并不令人惊讶，不过究其原因还是验证数据是否充分的问题，这也凸显了层析介质验证毒和保存尚未完成验证寿命期间的清洁验证数据柱两次使用之间的保存证不充分，因为缺少对内毒素和微生物限度的评估否基于验证过的分析方法清洁的验证数据本文将从现有的法规要求和生物药物开发实践出发，提出层析介质寿命和清洁验证的一种综合设计，可以满足产品和工艺需求以及监管机构的期望，并实现优异的工艺经4合设计层析介质的寿命验证是证明层析介质在其预期使用时间期限内能够维持其可接受的性能特征，并且可持续的生产出符合预期质量标准的产品。层析介质的寿命验证一般在层析介质的清洁验证则主要是证明清洁程序能够将层析介质的批次使用之间残留物的量最小化。层析介质清洁程序的开发一般在缩小模型上进行，而清洁程序的验证则需应包括保存步骤，PDA技术报告60-3号曾明确指出应证明层析有效的清洁程序往往是层析介质的稳定性与清洁有效性之间的平衡。因此，层析介质的清洁程序同时还影响了层析介质的寿命，需要对寿命验证、清洁和保存验证进行综结合法规要求、生物药物开发的实践要求，建议的层析介质寿命和清洁验证的程序步证层析介质的清洁程序本应是层析纯化工艺固有的一部分。特定的层析纯化必须要包含特定的层析介质清洁程序(表2-1)。序能的重要性质和有较染如寿命层析介质清洁程序的开发需要考虑两方面的因素，一是层析纯化工艺中所面临的杂质和污染物；二是选择合适的清洁工艺试剂(表2-2)。、异丙醇、丙酮对于不耐碱的层析介质则可以选择酸性条件清洁，比如pH3的乙酸或者磷酸溶液。其MMM异丙se于核酸杂质的去除，但是成本高，并且需要开发分析方法检测其残留和验证其清除，清洁和消毒试剂的类型和使用浓度与层析介质的兼容性密切相关。需要供应商提供层许多清洁工艺参数都会对层析介质清洁的有效性产生影响，这包括污染物与层析介质之间的相互作用的性质和程度、清洁工艺试剂与污染物之间相互作用的性质、清洁时间(脏的维持时间和清洁时间)、清洁试剂的类型和浓度、温度、清洁动作(流动特性，比如停滞、流动和压力)以及液体的特性(pH、电导率、粘度等)。除了清洁动作，。需要进行实验研究来考察清洁工艺参数。与层析纯化工艺参数的研究类似，可以首先使用风险管理工具，比如失败模式与效应分析(FMEA)，对清洁工艺参数的失败风险的实验研究。清洁工艺参数的实验研究可以在实验室规模上采用缩小模型进行，关于缩小模型的构建和确认，我们将在下述的章节进行详细讲述。实验室规模的清洁工艺参数研究可以使用单因素实验或者实验设计(DoE)的方式进行。实验设计的方法可以探索清洁工艺响。6A亲和层析介质的一步与两步清洁试剂[8]。两步清洁试剂可避免严苛的持层析介质的稳定性PDA”的概念[9]。设计空间是指能够提供质量保证的输入变量和工艺参数的多维组合。清洁工艺的设计空间可由每个清洁可接受性。对于成本较高的层析介质，比如蛋白A亲和层析介质，则需要开发特定的清洁和消毒382486420在实验室规模上选择的清洁工艺试剂和清洁工艺参数应能够实施在更大规模的工艺设备上。在进行正式的清洁验证之前，还应在大规模的生产中确认污染物的去除和清洁在工艺放大阶段可以基于工厂车间的历史经验和实验室规模的研究基础进行清洁工艺的调整。应在大规模的生产工艺中建立最终的清洁工艺操作和性能参数的操作范围，验证在缩小模型上进行层析介质的寿命验证可以前瞻性的提供层析介质使用寿命的预估，在层析介质的寿命验证中以空白运行的方式设计加入清洁验证，则可以在缩小模型的为减少规模之间的可变性，应尽可能使用与商业化规模生产工艺一致的原材料，包括使用相同质量标准的层析介质、过滤器、试剂和溶液等。设备之间的差异也应尽可能考虑后续还需要对寿命末期的层析介质进行病毒清除验证，层析介质寿命验证的缩小8缩小模型的确认一般采用统计学方法进行。使用缩小模型进行三批次的运行，工艺性能数据和收集样品的质量数据分别与商业化规模的工艺性能数据和收集样品的质量数据进行统计学比较，比如双单侧T检验(TOST)或者PCA分析，以确定缩小模型对商为减小模型与商业化规模工艺之间的差异，应尽可能选择与商业化规模工艺所用层析差异性最小的仪器设备。层析介质应选择与商业化规模所用的具有相同质量标准的层析介质，尽可能具有较小层析介质寿命验证选择使用的工艺参数可以设定在工艺表征研究(ProcessCharacterization以选择设计空间的上限进行，以层析介质寿命验证的检测指标可以包括层析柱评价指标，层析性能评价指标和产品质，比如理论塔板高度(HETP)和不对称因子(As)有助于指出重复使用的层析柱完整性的下降。•压力/流速性质，杂质的累积会导致压力的升高或者流速的降低，压力/流速性质的•层析图谱，包括UV、pH和电导率的层析图谱，是观察层析介质性能变化的最简单层析性能评价指标蛋白浓度测定(A280法)产品纯度产品杂质层析介质寿命验证并不是每个循环的取样样品都要进行全部检测指标的分析检测。为平衡验证数据需求和分析检测的工作量，通常每隔一定循环次数进行全部检测指标的对于可以简单分析检测指标或者可以高通量分析检测的指标可以每个循环都进行检测，表2-6：层析介质寿命验证检测计划(举例)T2TTTTTTTTTTTTT尽管不是每个循环的取样样品都需要进行全部检测指标的分析检测，但是每个循环都表2-7：层析介质寿命验证取样计划(举例)层析介质的使用寿命根据检测指标的标准来定义。检测指标的标准可以设定为一个具如果可接受标准为循环批次间的一致性，推荐采用统计过程控制(SPC)或者趋势分析表2-8：层析介质寿命验证的可接受标准(举例)无异常峰，洗脱峰一致符合规定标准(或收率不低于80%)产品质量评价指标产品纯度符合规定标准，循环间一致(或纯度不低于95%)产品杂质间一致间一致层析介质的使用寿命可以选择达到检测标准的循环次数数值，或者出现批间异常的循环次数数值，保守的做法还可以将确定的循环次数数值乘以一个安全系数，比如0.9，验证的设计为获得层析介质整个使用寿命期间的清洁验证数据，可以在层析介质的寿命验证设计法对于层析介质的清洁验证，目视检查和擦拭取样不太符合实际，因此淋洗水取样方法淋洗水取样是对包含层析介质的整套层析系统进行清洁后使用流水冲洗所有的相关淋洗水取样验证可以选择从清洁过程中的最终冲洗水中提取随机样品，另一个选择则是完整清洁程序后，使用单独的冲洗水定量冲洗，收集所有的冲洗水。两种淋洗水取样方法都适用于层析介质的清洁验证，不过两种方法也各有各的优势和劣势，空白对照取样验证通常不使用实际产品进行，而是使用只包括注射用水或者没有任何产品的水性缓冲液的生产加工过程。使用空白对照验证方法可以展现出真实加工期间使用模拟运行/空白运行(BlankRun)的方法来验证层析介质清洁程序的有效存层析柱。按照正常的操作规程进行层析过程，只是在正常的上样步骤中使用等体积的缓冲液按照正常的操作规程进行后续的层析纯化操作，在洗脱步骤中按照常规运行的收集检测，侧重检测产品和杂质的残留物。空白运行可以周期性运行，比如每隔10个循环进行一次空白运行，直到层析介质寿命对于一个清洁验证程序来讲，选择合适的分析检测方法是非常必要的。合适的分析检。清洁验证常用的分析检测方法包括特定分析方法和非特定分析方法(表2-9)[9]。特定分析方法，是检测特定残留物的方法，比如具有生物活性的物质。特定分析方法分析方法的选择取决于清洁程序后残留物的性质。尽管在大多数的层析纯化工艺中可能会残留具有生物活性的物质，比如相关产品物质。但是清洁工艺常使用碱洗或者酸质降解/灭活，因此特定分析方法可能不再科学合理，使含碳有机物的残留(ppb、ng/L)低分子量有机物残留(ng/Kg)蛋白质/核酸(ug/ml)蛋白质(10ng/ml)核酸(pg)FDA的法规指南“清洁工艺的验证(7/93)”中明确指出监管机构不期望对清洁工艺验证设定可接受标准，因为清洁验证的设备和方法都有所不同。生产企业应提供所设定的残留物可接受标准的科学依据，并且该标准应是实际可行的、可达到的并且如果是非特定分析方法，比如TOC。生物药物企业常建立的可接受标准通常为上游工ppmppm和超滤膜这些产品专用原材，但是要具有一定的科学依据[9]。对于特定生物药物工艺的相关杂质，生产企业则可自行设定可接受标准，低于检测限下面的案例即是一个层析介质寿命和清洁验证综合设计的案例，本案例设计层析介质121个循环，每隔10个循环的收集样品进行全部检测指同时在寿命验证期间周期性的进行了模拟运行，模拟运行是每隔10个循环进行一次。循环次数HCP(ppm)SEC-HPLC(%)HCD(ppb)蛋白A(ppm)19bHCD(ppm)•不仅提供了层析介质使用寿命相关的预估信息，同时还提供了层析介质使用寿命期•层析介质寿命验证中的模拟运行次数并不计入层析介质的寿命，因此提供了层析介质预估寿命的更加保守的估计，对于商业化规模上的层析介质寿命持续确认提供了尽管在缩小规模上综合设计了层析介质的寿命和清洁验证，但是还是需要在商业化规层析介质使用寿命的确认需要多批次的循环运行，这个在正式的商业化生产之前很难积累所需要的批次数目。而清洁有效性的确认可以不需要多批次的循环进行，因此可PQ传统方式的清洁验证方案一般要求评估至少连续三个批次的清洁过程。伴随着工艺性能确认(PPQ)批次进行商业化规模上的清洁程序验证可以在申报商业化生产时提供关。除此之外，层析介质的商业化规模清洁验证还可以提供常规生产规模上的微生物限度与缩小规模的清洁验证类似，商业化规模的清洁验证也可采用淋洗水验证方法或者采用空白对照运行(模拟运行/空白运行)方法。空白对照运行方法需要准备更多的缓冲液，所需时间也要长于淋洗水验证方法，但是空白对照运行方法能够更好的代表实际生产工艺中的残留物是否有机会进入到下一批商业化规模的模拟运行程序与缩小模型的模拟运行程序一致，除了使用注射用水或者水性缓冲液来代替上样样品进行上样外，其余程序均一致。商业化规模的模拟运行使商业化规模清洁验证的分析方法和可接受标准的制定与缩小模型清洁验证可以保持一案例的层析介质清洁验证是伴随三批次的工艺性能确认(PPQ)进行，采用模拟运行的包括正常的消毒、清洁和保存程序，进行模拟运行，上样阶段使用平衡缓冲液来代替洗脱阶段，按照正常批次的标准操作规程，常规收集标准是在0.8CV开始，共收集该案例生产工艺共包括蛋白A亲和层析、阳离子交换层析和阴离子交换层析三步层析09nan/a此工艺验证的概念逐步进化。监管结构也逐渐意识到三批次成功的验证批次并不意味在产品获批进入商业化生产之后，仍需要一个持续工艺确认的方案来确认在商业化生产规模上，层析介质可一致的处于验证过的受控状态，比如使用寿命、残留物累积、对于层析介质使用寿命，应持续监控在预估的使用寿命期间的层析步骤收率、工艺相关杂质和产品相关杂质的去除，以及该步骤相关的其他检测指标，以确认层析介质和对于层析介质的清洁状态，可通过持续的监控清洁工艺参数，比如清洁剂浓度、接触时间、清洁温度等确认清洁工艺处于受控状态。也可进行商业化规模的模拟运行，比PAT工艺过程控制的准确性和精确性，后变更的原因可能来自于工艺改进、新技术的引入、厂址变化、设备/原材料的变层析介质的变更需要重复上述的验证研究，针对特定的变更方面可能还需要加入新的。商业化规模的验证或者确认是必须的，需要确认变更前后的层析介质在工艺性能和产如果该步骤的变更导致产品杂质含量或者产品质量超出了之前建立的可接受范围，那尽管层析介质供应商可以提供相应层析介质在其保存试剂条件下的长期稳定性数据和•层析介质供应商的保存实验数据都是使用新介质(未使用过介质)获得。散装保存条件下进行。真正的生产过程中，层析介质的保存有可能是拆装后的散装保存，也可能是直接在装验证选择使用次数≥10次的层析介质，按照其相应的保存条件(保存缓冲液、保存缓冲液浓度和体积)在供应商提供的盛放容器或者生产条件下的盛放容器中进行保存，保存确保完整记录层析介质的批次、使用次数、纯化的产品、保存缓冲液类型、保存缓冲液的批号、保存缓冲液浓度及其配制日期，还需要记录保存容器的材质、保存的房间层析介质初始进入保存缓冲液的日期即为开始保存的日期，该日期设置为T=0点。在T定的需要进行的功能性检测，比如动态结合载量、配基密度含量、粒径分布或者压力流在上述保存条件下保存该层析介质至规定期限，比如一年。在更换保存缓冲液之前，按照T=0点的取样方法进行取样，检测微生物限度、内毒素以及设定的需要进行的功能性检测。取样完毕后，更换新鲜的保存缓冲液，并进行记录。直至完成三次的保存微生物限度和内毒素的可接受标准可依据供应商提供的标准，或者生产车间自定的标准。功能性测试的可接受标准应该是新填料的放行分析标准范围。对于使用次数有影响的层析填料，比如蛋白A亲和层析填料，则需要跟T=0点的数据来比较。±20%的存验证装柱条件下的层析介质保存验证也需要选择使用次数≥10次的层析介质。如果层析介质没有达到使用次数，应更换其他批次的填料。在进行层析介质装柱之前按照散装填料的取样方法进行取样，后续进行相应的功能性测试，比如动态结合载量、配基密度按照相应的装柱操作规程进行层析介质装柱，并检测柱效(HETP和As)合格。使用平测流出液的pH和电导率与平衡缓冲液一致，收集流出的平衡缓冲液进行微生物限度和内毒素检测，此时设定为T=0点。取样完毕后，使用保存缓至保存期限，比如4个月后，使用平衡缓冲液冲洗层析柱，检测流出液的pH和电导率与平衡缓冲液一致，收集流出的平衡缓冲液进行微生物限度和内毒素检测。对于功能性检测的取样，则需要在洁净条件下拆开层析柱，使用平衡缓冲液重悬层析介质，并进行取样。最后按照相应的装柱操作规程进行层析介质装柱，并检测柱效(HETP和As)合格。直至完成三次检测。装柱条件下的层析介质保存验证的可接受标准与散装条件一致。微生物限度和内毒素的可接受标准可依据供应商提供的标准，或者生产车间自定的标准。功能性测试的可接受标准应该是新填料的放行分析标准范围。对于使用次数有影响的层析填料，比如T最后，如果有条件，建议进行散装或装柱条件下保存验证的相同批号的层析介质在完介质的性能。尽管可以开发清洁程序对层析介质进行清洁和消毒以维持生产工艺的性能和产品质量，但严苛的清洁程序也会对层析介质自身带来不利的影响，影响层析介质的寿命。在生产工艺中采用一些预防步骤可减少对清洁程序的负担，甚至可以减少对寿命和清洁验可以采取预防步骤来减少收获上清中的杂质蛋白、低分子量物质和脂类物质。这些杂质都会非特异性结合层析介质，堵塞层析介质的孔道，造成层析介质的污染。采用絮去除上述杂质。操作人员是污染物最大的来源。GMP操作可以最大限度的防止污染物的引入，合适的人员培训、正确的洁净穿衣、清洁程序的维持、生产区域的严格控制进入都可以减少层析纯化工艺中，层析介质是直接接触产品的原材料，也是潜在的污染物污染源。供污染物数量。0另外，层析介质封闭操作，比如智能自动层析柱装填、操作和拆卸，不仅可以实现高水平的污染物控制标准，还能获得很好的层析工艺重现性和一致性。这对于某些步骤生产工艺。82364751层析纯化所需要的大体积的缓冲液是引入污染物的潜在来源。减少缓冲液配制的手动在线配液系统(IC)，既减少了需要配制的缓冲液的体积，同时使得污高。3：Cytiva在线配液(IC)系统可以减少人工操作和污染物引入风险层析介质作为生产工艺中的关键原材料，对生产工艺和产品质量的一致性控制至关重•产品放行报告(COA)。数据质量体系完善的层析介质供应商都会提供其层析介质在推荐的CIP条件下的稳定性数据，尽管该数据并不能完全代表实际生产工艺条件下层析介质的稳定性，但是该数据可以为实际生产工艺中层析介质的使用寿命提供预期的估计，并为层析介质的寿命验P还可以减少清洁验证中残留物的累积风险。从工艺经济性来讲，还降低了清洁工艺的关于层析