兽医生物制品学第4章兽用疫苗生产与质量控制

第四章 生物制品的研品的出口问题生物制品管理办法》、 新生物制品管理办 二、菌（毒）三、菌（毒）

灭活（脱毒）或浓缩、加佐剂等，

活 2诊 与处理

试血 的处菌（毒）致病性微生物，一般用于制造灭活 弱毒，常用于制造 、诊断试剂因此对菌（毒）种必须加强管理，防止散毒和丢失。1（毒）生物学性状明显遗传性状稳定纯净（粹）免疫原性良好安全可靠 。毒力在适当范围内：灭活应该是强毒，弱安全，中等毒力的如ND-I系，IBD 原

2（毒）种的选育（图强强性质弱毒力毒 来源制造弱灭活 用途抗 和抗毒素 诊断制品 血液制 微生态制剂的毒 标准攻毒株

天然的（强、弱毒）毒株改造的（致弱毒株、菌种毒种虫种工程菌株）菌种毒种虫种弱毒菌（毒）弱毒菌（毒）影响，且真空保存的菌（毒）种保存期长。有些毒株如 体的细胞种也在-196C的液氮罐中保存。弱冻干保护剂亦称稳定剂，是指冷冻真空干燥生物制品中抗原活性物质以外的添加物。能防止在冻干过程中活性物质失去结构水及结构水形成结晶，保持 中微生物在干燥状态下 复苏时迅速 力1010%蔗糖、5%蔗糖脱脂乳、5%蔗糖、1.5%明胶；10—20乳、含1%谷氨酸钠的10%脱脂乳；5%牛白蛋白的蔗糖；含0.1%谷氨酸钠的10%脱脂乳，10%脱脂乳，7.5明胶、、谷氨酸钠、羊水、蛋白胨、蔗糖、乳糖、山梨醇、葡萄糖、牛白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、水解乳蛋白、活马

菌（毒） 告第2139号（核发兽药GMP 可证）鸡病专业网-养鸡与鸡病防治门 菌（毒）种是生产必备的原材料，国生产的菌（毒）种来源：中国兽兽品监察所或其委托的保管单位进行生产、鉴定和保管，生产用批由企业 家法定标准。..\农业部公告第1801号――关于发 (VG-GA株)制造及检验规程、质量标准、说明书和 是可行的，并报农业部评准，形成新《规程》 GMP 污水处理站锅炉房脾林苗质检楼厂房菌（毒） 物、禽胚或细胞等） 收获抗原（培养 配分装 冻干成活 或灭活后制成 生产用生产用 分装冻干、扎盖帖活 活 健康动物（或胚胎健康动物（或胚胎 细胞悬液生产用种毒细胞悬液

传代细胞液液液液活配苗（混匀 佐活分装冻干分装冻干 健康动物或SPF健康动物或SPF生产用种毒健康动物或SPF灭 配苗 分装分装活活 活生产用菌（毒）种 是否优制苗用抗 （微生物增殖）是否高生产用菌（毒）种 是否优制苗用抗 （微生物增殖）是否高 养）生长繁殖的过程。细菌性都是利用培落，细菌，然后逐级培养进行规模化 活物理性状（冻干苗无菌检验（纯粹检验鉴别检验：特异 中和检验外 检验 ）：中和法检验活菌计数（细菌 ）：平板计数 ）：EID50、ELD50或TCID50。安全检验：动物或鸡胚（剂量几倍至几十倍水份测定（冻干苗）：4TCID50。

松），将细胞单层消化成单个细胞；

工艺使其降温至-70℃；德国引进R921 1必须选择SPF达512效价达 2 入孵前进行熏蒸； 3接入到尿囊腔内；左右；将后孵至72-96小时的鸡胚置4℃冷却6； ；胚液HA达512 缩（产品的均一与稳定）；引进 浓缩。。56水）；份）、包装（即时包装）。德国STERIS公司引进LYOVAC冻干机德国引进BOSCH全自 分装线德国引进BOSCH全自 分装线德国引进BOSCH全自 分装线外 检 严重受损（尤其是活）或剂型破坏，并导致失效，因此应严格在规定的条冷冻真空干燥可以保护蛋白质不变性，减少氧化环节，微生物活性和某些酶不受影响，且真空封口保存的产品具有保存时间较长、使用时加稀释液能迅速溶解、复原性状不变等许多优点。应用：活与抗等生物制品，在医药工业和食品工业方面(抗生素、维生素、 液或悬浊液，因此其冰点与水同。水在0C时结冰，而海水却要在低于0C的温度才结随着温度的下降，晶体的数量不断增加。直到最后，溶液才全部凝结。这样，溶液并不是在某一固定温度时凝结，而是在某一温度范围内凝结，当冷却时开始析出晶体的温度称为溶液的冰点。而媒共同熔化的温度点。所以又叫做共，或溶液的冰点与共是不相同的。共才是熔液真正全部凝成固体的温度。共的概念对于冰冻干燥是重要的，因为冻干产品是一种复杂的液体，它的冻结过程肯定也是一个复杂的过程，与溶液相似，也有一个真正全部凝结成固由于冷冻干燥是在真空状态下进行，只有产品全部冻结后才能在真空下进行升华，否则有部分液体存在时在真空下不仅会迅速冒出来，造成象液体沸腾的样子，使冻干产品鼓泡、甚至冒出瓶外。为此冻干产品在升华开始时必须要冷到共以下的温度，使冻干产品真正全部冻结。 共的测定：电阻法，冰冻溶液在-40℃电阻突然降低，此时温度叫共，水分子共的数值从0C-40C不等，与产品的品 6.3 6.4冷冻干燥的程序：在冻干前，把需要冻干的产品分装在合适的容器内，一般是玻瓶或安瓿，装置要均匀，蒸 面尽量大而厚度尽量薄些；然后放入与冻干箱尺寸相适应的金属盘内。装箱之前，先将冻干箱进行空箱降温，然后将产品放入冻干箱内进行预冻，抽真空之前要根据冷凝器、冷冻机的降温速度提前使冷凝器工作，抽空时冷凝器应达到-40C左右的温度，待真空度达到一定数值后(通常应达到13.33Pa以上的真 ①升华干燥：真空条件下（10—30Pa），加热 ②解析干燥：使 ④解析干燥时的温度：非生命物质可以到40℃, 18— 3.6猪瘟 产品介类型使用种毒抗原方质量标准生产成本临床使用猪瘟活疫苗（成兔脾淋源猪瘟兔化弱150个高非特异免疫强抗原含量高过敏率低猪瘟活疫苗（乳兔源）猪瘟兔化弱150个较高无非特异免疫抗原含量较低过敏率高猪瘟活疫苗（细胞源）猪瘟兔化弱培养液750个（新标准7500RID）低抗原含量高，过敏率较高猪瘟活疫苗（牛体源）猪瘟兔化弱150个较底非特异免疫强抗原含量高过敏率低 纯净（细菌和外 毒污染代次控制在5 诊断剂；是利用微生物，，及其代谢产物，及高免制成,用于鉴定微一）诊断抗原：用已知抗原成分，来检测未知抗体 1、凝集反应抗原：常见有鸡白痢、布氏、马，下面讲鸡白痢沙门氏菌全血平板抗原步骤； 反应，多用于胞内细菌，病测 —高压灭菌水解—滤器过滤—剀氏定二） 因子：是仅含某主要抗原的抗体。。 三）为买商品，一般单位不自己。 荧光素主要有异硫酸荧光素(FITC)或罗达（二）乳过氧化物酶法 免 制造流一）动物的选择与管理二）免疫原三）四）血 五）几种重要畜禽用免疫 六）免疫 又称高免 疫制品。经过反复多次注射同一动物体，促使动物不断产生免疫应答，在 对应的特异性抗体而制成。分类（据免疫 作用的对象不同）：抗病和抗毒素。2 谓的人工 免疫。当动物已 3、应用用作紧急预防注射，通常是在已经发生传染 缺点：持续期短（一般仅2~3周）目前生产较多的抗 有：破伤风抗毒素 动物的选择与管理→免疫原的 →免疫程序→血液 提取一）（一）1、动物的品种 用同种动物产生的称同源 用异种动物生产的称异 多用同种动物。如犬瘟 免疫 用马较多，也可使用多种动物（如马、牛、羊三种动物） 。选定动物应有一定的数量，一个批次应用多头动物。 及健康情 马 察2周以上，确认健康者方可应用。（二）1、动物应在 时散毒。2、应详细登记每头动物的来源、品种、 料。随时观察其健康情况。每日至少运动4h。动物采血前1d禁食喂水，避免血中出现乳糜。5、在生产过程中，若发现健康状况异常或有患病 疗。（一）理性状。一般来说，颗粒性抗原较可溶性抗原的抗原性（二）1基础免疫用抗原多为 或死菌，而高度免疫的抗原，一般选用毒力较强的毒株。多价抗病用的抗原，要求用 型菌株细菌抗原：培养→洗菌苔→离心→计数→稀释为含菌100亿/毫升→灭活（水浴80℃2h或加0.4%甲醛37℃24~48h）。2、 3、抗毒素免疫原可用类毒素、毒素或全培养物（活菌加毒素），但后两者只有在需要加强免疫刺激的情况下三）高度免疫（加强免疫采用多部位注射法。隔时间1~2周，剂量逐渐加大。首免1头份→1~2 份。3~5次），间隔1周。基础免疫后2周第一次加强免疫 体效价→符合要求→采血→ （高免的注射次数要 抗体效价而定。有的只要大量注，才能产生高效价的免 。（三） 四）血 提（试血）， （一）1、采血时间一 抗体的效 在最后一次免疫后的2 34、采血部位豚鼠由心脏穿刺采血；家兔可以从心脏采血或颈静脉、颈动脉放血，少量采血可通过耳静脉采取；颈动脉或颈静脉放血；羊可从颈静脉采血或颈动脉、颈静脉放血；家禽可以心脏穿刺采血或颈动脉放血。（二 采血时一般不加抗凝剂，全血在室温中自然凝固，在置于371~2h，然后置于4℃冰箱过夜，次日离心收集。 提取的 放入灭菌瓶中，加入0.5%石炭酸或0.02%硫柳防腐。放置数日作无菌检验。无菌 ，组批分装，保存于－15℃半成品库，待 （一）1、动物的选择

抗的多用同种动物；通动物。选用60kg左右，健康、营养良好的猪2、免疫原基础免疫：高度免疫：血毒基础免疫用抗原多为疫，而高度免疫的抗原，一般选用毒力较强。3、免疫程序 基础免疫注射猪瘟兔化 （2）高度免疫

免疫剂量基础免疫后隔14～21d第一次高免，肌肉注射血毒第二次，肌肉注射血毒第三次，肌肉注射血毒300ml；每次间隔10d4、血液第三次高免后9～11d（二）1、动物的选择选择5～122、免疫原基础免疫：破伤风类毒素高度免疫：血毒3、免疫程序 基础免疫第一次， 制破伤风类毒素油佐剂抗原第二次，注射2ml（2）高度免疫基础免疫1～3第一程高度免疫，一般注射5～8针，1～4针各针之间间隔2～3d，5～8针各针之间间隔4～6d。抗原量每针递增1～2ml。第5次开始试血至第8次。第一程采血后，休息14～16d后进行第二程高度免疫，第二程高度免疫，一般免疫3次，间隔5～7d，最后一次免疫后7～9d采血。4、血液

第 免最后一次免疫后6～7d采血，第免最后一次免疫后7～9d采血，隔1天再次采血，检测效价。5 的纯化 20%硫酸铵进行沉淀，然后加入10%的明矾使明矾含量为1%，静置使之沉淀。取沉淀后的上清加38%的硫酸铵沉淀，沉淀物经透析即成精制破伤风抗毒素。（三）1、动物的选择选择健壮马匹2、免疫原基础免疫：炭疽 （无毒炭疽芽孢苗或Ⅱ号炭疽芽孢苗）3、免疫程序 基础免疫 于第、、、日共进行次基础免疫。（2）高度免疫用炭疽强毒或炭 ，于第、、、、、、、、、、日共高免次，剂量递增。4、血液和第45日试血，试血合格后，再按最后一次的剂量免疫一次，7～8d后采血分离，加防腐剂，密封于冷暗处，静置1～2个月使之澄清，经检验合格后分装。（四）1、定义通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应得抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，该类制剂称为卵黄抗体。连续生产。缺点：有潜伏野毒 2 过程例如：IBD（鸡传染病法氏囊病）达1：128时开始收集高免蛋，4℃备用。琼扩效价降将高免蛋用0.5%，再 棉擦拭蛋壳，打取鸡卵分离蛋黄行稀释（稀释后的卵黄抗体琼扩效价不低于1：16~1：32），加青、链霉素各1000IU/ml，加硫柳浓度达0.01%，充分搅拌后分装于灭菌瓶内 六）免 早效果越好。 的用量根据动物的体重 不同而定预防量，大动物10~12ml，中等动物（猪、羊等）5~10ml；以皮 射为主，也可肌肉注射。治疗量，按预防量加倍，并根据病情采取重复注射；注射方法以静脉为好，以使其尽速奏效。 射1：100肾上腺素，大动物5~10ml，中小动物2~5ml微生态制剂的英文名“probioties”，源于古希腊语，意为“forlife”(有益于生命)，我国有人翻动物健康状况。拌料或溶于水中。也可局部使用（如用于上呼吸道、及生殖道）和喷雾使用试验的1菌株的生物安全性生产和加工的可能性微生态制剂的使用及菌株保持所必须的条件。的安全（GRAS）菌。此外应尽量选用与靶动物性良好的菌株。2生产微生态制剂的菌种3几种微生态制剂的生产方法3.1包括蜡样芽孢杆菌和枯草杆菌，蜡样芽孢杆菌(B.cereus)菌株有：DM423SA38、N42、BC901、BNL4和枯草杆菌(B.subtilis)有：BNLl、BNL2、BC”“乳”、“止痢灵”等。特点：对高温的耐受力强，因而适于制成各种养要求不高。一般通气培养18～24小时，芽孢形成率就能达到90％以上，此时即可收获菌液。如果要制成赋形剂（医用淀粉、碳酸钙粉、食用淀粉、玉米粉等）或将赋形剂直接加入菌液中调匀成糊状，并置40～50C左右中烘干。制片或制粒。乳杆菌制剂乳杆菌(Lactobacillus)乳球菌(S.1actis)主要是粪链球菌(J．faecalis)或尿链球菌(S.faecium)。营养吸收，促进代谢，克服过程。在防治动 双歧杆菌制剂双歧杆菌(Bifidobacterium)是寄生在人、动物小肠下段的重要正常菌群，起着微生态平衡的作用，与动物和的许多生理功能如生免疫功能等有关，特别是肠道细菌间的生态平衡，