乙肝病毒检测课件

病毒鉴定方法一、分离培养方法二、快速诊断方法1、光学显微镜检查

病毒包涵体及某些大病毒颗粒的检查2、电子显微镜的检查

电镜直接检查免疫电镜检查3、血清学检查4、病毒基因组检查核酸杂交和聚合酶链反应乙肝病毒检测一、乙肝五项（两对半）二、乙肝病毒核酸定量检测

HBV抗原抗体系统检测临床意义HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc临床意义IgMIgG+-----感染或无症状携带者+-+-+-急性或慢性乙型肝炎（传染性强）（大三阳）+--+-+急性肝炎趋向恢复（小三阳）-+-+-+既往感染恢复期-+-+--既往感染恢复期-----+既往感染-+----既往感染或接种疫苗------未感染，无免疫力二、乙肝病毒核酸定量检测

1.检测原理

利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。

荧光探针TaqMan探针实时荧光PCR技术。在PCR反应过程中，同时利用Taq酶的5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得TaqMan探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，FAM荧光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610nm波长通道检测内参。

PCR分四个阶段O<1为HbeAg阳性（含HbeAg阳性血清）在PCR反应过程中，同时利用Taq酶的5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得TaqMan探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射，FAM荧光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610nm波长通道检测内参。93℃45秒→55℃60秒→10个循环洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）C<100,HBVDNA浓度<100IU/ml洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）未结合SYBRGreen1dye（含HbeAg阳性血清）HBV定量参考品（2.2FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于300E+008,HBVDNA浓度=CIU/ml一、乙肝五项（两对半）Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。一、乙肝五项（两对半）HBV抗原抗体系统检测临床意义4实验无效，应重新实验（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。定量原理

确定初始模板的浓度初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量荧光化学SYBRGreen1

TaqManTaqManSYBRGreenI工作原理

。SYBRGreen1

结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1

染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT未结合SYBRGreen1dye变性:无荧光信号2.所用试剂组分名称规格数量主要成分

核酸提取试剂DNA提取液I4.5ml/瓶2DNA提取液质控品及阳性定量参考品阴性质控品250ul/管1HBV阴性血清强阳性质控品250ul/管1灭活HBV阳性血清临界阳性质控品250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X106IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X105IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X104IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清HBV定量参考品（2.0X103IU/ml）250ul/管1灭活HBV阳性血清

PCR检测试剂HBV-内标溶液100ul/管1内标质粒及稳定剂HBV-PCR反应管1人一份/管20引物、探针、taq酶等3、实验步骤1.DNA提取

将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品进行同步处理。1.1取200μL样品，加入450μLDNA提取液I和4μL内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100℃处理10分钟1.212000rpm离心5分钟，备用2.PCR试剂准备直接使用HBV-PCR反应管3.加样HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品上清20μL。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后扩增4.PCR扩增对各标本进行标记反应条件：93℃2分钟93℃45秒→55℃60秒→10个循环93℃30秒→45℃60秒→30个循环FAM通道检测HBV核酸，VIC通道检测内标4.结果判定1如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度2FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30按以下方法判断：C<100,HBVDNA浓度<100IU/ml100≤C≤5.0E+008,HBVDNA浓度=CIU/mlC>5.0E+008,HBVDNA浓度>5.0X108IU/ml如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBVDNA浓度=（CX稀释倍数）IU/ml5.注意事项1每次实验需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品，满足要求方可进行判定（阳性质控品Ct<30，阴性质控品无明显对数期或Ct值等于30VIC检测通道扩增曲线有明显对数期）2本试剂盒的最低检出浓度为30IU/ml，最低定量浓度为100IU/ml3所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。一、乙肝病毒e抗原检测

1.检测原理

在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）

临界值=阴性对照孔OD值均值NX2.（包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb））二、乙肝病毒核酸定量检测急性或慢性乙型肝炎（传染性强）（大三阳）核酸提取试剂二、乙肝病毒核酸定量检测注意：阴性对照孔均值N大于0.免疫电镜检查利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。0X104IU/ml）0E+008,HBVDNA浓度>5.93℃30秒→45℃60秒→30个循环Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。一、乙肝五项（两对半）4实验无效，应重新实验2FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于3093℃30秒→45℃60秒→30个循环洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果分别用加样器加入阳性对照血清、阴性对照血清50μL（各加两孔），待测血清50μL（1孔），空白对照（不加）一、乙肝五项（两对半）在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）2.所用试剂组成成分规格组成成分规格1.HbeAg微孔板（包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（

HbeAb））96TX块7.底物B（过氧化氢）7mlX1支2.HbeAg酶标抗体（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）3.5mlX1支8.终止液7mlX1支3.HbeAg阳性对照血清（含HbeAg阳性血清）1mlX1支9.封口膜2张4.HbeAg阴性对照血清（正常人血清）1mlX1支10.自封袋1个5.浓缩洗涤（PBS-T缓冲液）12.5mlX1支11.说明书1张6.底物A（过氧化氢）7mlX1支

3、实验步骤1.平衡

试剂盒个组分取出，平衡至室温（16-25℃）余者以自封袋封存2.配液浓缩洗涤液摇匀后，用蒸馏水或去离子水按1:19稀释备用3.编号微孔条固定于支架，按序编号4.加样

分别用加样器加入阳性对照血清、阴性对照血清50μL（各加两孔），待测血清50μL（1孔），空白对照（不加）5.加酶

每空加酶标抗体50μL，混匀（空白对照不加）6.温浴37℃温浴25分钟，室温平衡5分钟（封口膜覆盖孔口，避免其他因素影响）7.洗涤

洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）8.显色

每孔加入A、B底物50μL，混匀，37℃暗置15分钟9.终止每孔加50μL终止液50μL，混匀10.测定

酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记录结果,30分钟内测定完成）4.结果判定1.临界值(C.O)计算临界值=阴性对照孔OD值均值NX2.1

注意：阴性对照孔均值N大于0.1应重新实验，小于0.05按0.05计算2.结果判定样品OD值/C.O≥1为HbeAg阳性样品OD值/C.O<1为HbeAg阳性3.阴性对照孔均值N大于0.1或阳性对照均值≤0.4实验无效，应重新实验5.注意事项1.洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果2.所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。3.微孔板拆封后，取出当天用的微孔条后，其余用封口膜封存避免受潮PCR分四个阶段如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。4.结果判定1如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度2FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30按以下方法判断：C<100,HBVDNA浓度<100IU/ml100≤C≤5.0E+008,HBVDNA浓度=CIU/mlC>5.0E+008,HBVDNA浓度>5.0X108IU/ml如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBVDNA浓度=（CX稀释倍数）IU/ml0E+008,HBVDNA浓度=CIU/ml0X104IU/ml）1或阳性对照均值≤0.酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记录结果,30分钟内测定完成）0E+008,HBVDNA浓度>5.1如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度HBV定量参考品（2.HbeAg阴性对照血清HbeAg阴性对照血清FAM通道检测HBV核酸，VIC通道检测内标0X108IU/ml如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBVDNA浓度=（CX稀释倍数）IU/ml每空加酶标抗体50μL，混匀（空白对照不加）（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）一、乙肝五项（两对半）0E+008,HBVDNA浓度>5.在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）每孔加50μL终止液50μL，混匀Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。1取200μL样品，加入450μLDNA提取液I和4μL内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100℃处理10分钟C<100,HBVDNA浓度<100IU/ml洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品上清20μL。将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、HBV临界质控品进行同步处理。0X108IU/ml如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBVDNA浓度=（CX稀释倍数）IU/ml在微孔板上预包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb），配以辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体（HbeAb-HRP）及TMB（四甲基联苯胺）等试剂，采用双抗夹心法检测血清中的乙肝病毒e抗原（HbeAg）（含HbeAg阳性血清）SYBRGreen1每孔加入A、B底物50μL，混匀，37℃暗置15分钟（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）3所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。每孔加入A、B底物50μL，混匀，37℃暗置15分钟质控品及阳性定量参考品Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。93℃30秒→45℃60秒→30个循环2FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30二、乙肝病毒核酸定量检测HbeAg阴性对照血清利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。0E+008,HBVDNA浓度=CIU/ml（含HbeAg阳性血清）2.所用试剂组成成分规格组成成分规格1.HbeAg微孔板（包被鼠抗-Hbe单克隆抗体（

HbeAb））96TX块7.底物B（过氧化氢）7mlX1支2.HbeAg酶标抗体（辣根过氧化物酶标鼠抗-Hbe单克隆抗体）3.5mlX1支8.终止液7mlX1支3.HbeAg阳性对照血清（含HbeAg阳性血清）1mlX1支9.封口膜2张4.HbeAg阴性对照血清（正常人血清）1mlX1支10.自封袋1个5.浓缩洗涤（PBS-T缓冲液）12.5mlX1支11.说明书1张6.底物A（过氧化氢）7mlX1支

利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。2FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于301如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度93℃30秒→45℃60秒→30个循环核酸杂交和聚合酶链反应HBV定量参考品（2.洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果0X106IU/ml）盖紧管盖，8000rpm离心数秒后扩增浓缩洗涤液摇匀后，用蒸馏水或去离子水按1:19稀释备用1取200μL样品，加入450μLDNA提取液I和4μL内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100℃处理10分钟Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。质控品及阳性定量参考品93℃45秒→55℃60秒→10个循环二、乙肝病毒核酸定量检测引物、探针、taq酶等二、乙肝病毒核酸定量检测2FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30洗涤时各孔均加