药典无菌检查法与微生物鉴定

2015版药典无菌检查法与微生物鉴定方法药品检验与研究所抗生素室无菌

是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。无菌检查法用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。无菌操作

是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。无菌技术

是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。无菌检查法的局限性由于无菌是一个相对的概念，因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识－即产品通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发现有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的。反之，当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物污染风险相当高。从理论上来说，要确定某批产品的无菌性，应对每个容器进行无菌检查。但是无菌试验对样品是破坏性的，因此不可能对每一最小包装的产品进行检查。统计概率的局限性：对于低污染水平的产品，其局限性在统计学上更为明显。检验条件的局限：样品中污染的微生物的检出受多种因数的影响，只有在各检验条件符合污染微生物的修复和生长时，才能保证被检样品的无菌检验结果的准确性。污染的检出率要比实际产品的污染率低。无菌检查存在检查失误的可能性：这可能是因为污染菌浓度太低，或是污染菌生长太慢，或是因为培养基不良等原因，在培养期间污染菌根本就不生长。产品的染菌率愈小，错判合格的可能性就愈大。所以在评价某个无菌制品的某个批的无菌状态时，仅依靠最终产品的无菌检查是不充分的，局限性较大。对无菌制品来说，生产最终产品的所有系统的工艺才是最重要的。2015版中国药典无菌检查法2015版中国药典无菌检查法的修订无菌检查法的方法适用性试验无菌检查法的注意事项2015版中国药典无菌检查法的修订实验环境的修订检查用培养基的修订具体修订内容实验环境的修订2010年版2015年版无菌检查：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内或隔离系统中进行。无菌检查：应在洁净度B级背景下的局部A级单向流空气区域内或隔离系统中进行。 微生物限度检查：应在洁净度10000级背景下的局部100级单向流空气区域内进行。 微生物限度检查：应在受控洁净环境下（不低于D级）的局部不低于B级单向流空气区域内进行。修订的依据修订依据及意义：2010版GMP附录一《无菌药品》和附录三《生物制品》中均规定，非最终灭菌产品各工序关键操作环境应为B级背景下的A级。无菌检查的洁净环境不得低于生产关键区的洁净环境要求！ICH：检查方法中要求“试验应在无菌条件下进行，防止微生物污染的措施不得影响供试品中微生物的检出”。20舰15版中魔国药私典通钻则92唐03药品迫微生洁物实稠验室估质量住管理弯指导洒原则92么05药品勾洁净支实验杆室微下生物嗓监测归和控液制指兼导原允则92鄙06无菌泄检查杂用隔娱离系许统验努证指脖导原拥则GM登P2死01鞠0年版蔽对洁寸净度腥的规扇定及井确认记标准－50100200不作规定不作规定290003520000D级－25501002900035200002900352000C级555102900352000293520B级<1<1<1<120

3520203520A级5指手套cfu/手套接触碟/（f55mm）cfu/≥5.0μm≥0.5μm≥5.0μm≥0.5μm表面微生物沉降菌（f90mm）cfu/4h(2)浮游菌cfu/m3动态静态微生物监测的动态标准(1)悬浮粒子最大允许数/立方米洁净度级别无菌以隔离推系统腔的使忆用及者验证92脚06无菌出检查溉用隔顶离系微统验席证指放导原酒则1.操作许验证2.完整脚性验熄证3.灭菌罪验证4.灭菌遗循环秒验证5.内部穷洁净松度验柴证6.仪器俘仪表革验证培养棒基的佛修订我国斜药典没无菌理检查无法与叶欧美叹药典润的差槽异20删15版药端典的交修订比较项目ChP2010USP35EP7.0检验条件规定总体10000级、局部100级应在无菌条件下进行。应在无菌条件下进行。人员要求具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训经培训和认可经培训和认可培养基、培养条件与时间硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃；20～25℃(三部）改良马丁培养基

23～28℃均培养14天，转种后细菌培养2天、真菌培养3天硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃胰酪大豆胨液体培养基20～25℃

培养不少于14天转种后培养不少于4天硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃胰酪大豆胨液体培养基

20～25℃培养不少于14天转种后培养不少于7天培养基灵敏度检查与方法验证用菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉检验方法只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法性状允许的样品采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除采用薄膜过滤，利于抗菌影响去除稀释剂与薄膜过滤冲洗液1、0.1％蛋白胨水溶液；2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液3、其他经验证过的溶液1．0.1%蛋白胨水溶液；2．0.1%蛋白胨水溶液＋1ml吐温803．动物组织消化液＋牛肉浸膏＋吐温801．0.1％蛋白胨水溶液2．0.1％蛋白胨水溶液＋0.1％（聚乙氧基乙醇、0.1％吐温-80）3．十四烷酸异丙酯。结果判断与复试规定一次检出结果为准(设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试)2010年版2015年版硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃（20～25℃）硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃（20～25℃）改良马丁培养基23～28℃胰酪大豆胨液体培养基22～25℃营养肉汤培养基沙氏葡萄糖液体培养基胰酪大豆胨液体培养基营养琼脂培养基胰酪大豆胨琼脂培养基改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基培养壮基的侮主要颈修订硫乙耐醇酸婶盐流爽体培协养基榆（Fl榜ui麻d氏Th母io职gl搁yc蓬ol央la趴te伞M渗ed笔iu被m）药典USPBP中国药典-2015名称FluidThioglycollateMedium硫乙醇酸盐流体培养基FluidThioglycollateMedium硫乙醇酸盐流体培养基FluidThioglycollateMedium硫乙醇酸盐流体培养基目的培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧和微需氧微生物（主要是厌氧菌）培养需氧、厌氧微生物培养条件14天于30-35°C及20-25°C配方PancreaticDigestofCasein(胰酪蛋白胨)....................15.0gYeastExtract(酵母浸出粉)..................................5.0gDextrose(葡萄糖)............................................5.0gSodiumChloride(氯化钠).....................................2.5gL-Cystine(L-胱氨酸).......................................0.5gSodiumThioglycollate(硫乙醇酸钠)..........................0.5gAgar(琼脂).................................................0.75gResazurin(刃天青).........................................1.0mgWater（水）................................................1000ml大豆唤胰酪预胨培把养基(T畅SB谜)旅&改良哗马丁孙培养砖基药典USP36BP-2013中国药典2010版中国药典2015版名称TrypticSoyBroth（Soybeancaseindigestmedium)大豆－胰酪胨培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基配方胰酪蛋白胨..…………….…..7.0g大豆木瓜蛋白酶消化物………………….3.0g氯化钠…..…………….…….…5.0g磷酸氢二钾…....2.5g一水葡萄糖……………….……2.5g蛋白胨……………..5.0g酵母浸出粉…….…2.0g葡萄糖…………....20.0g磷酸氢二钾………..1.0g硫酸镁(MgSO4.7H2O)….0.5g胰酪胨„„„„„17.0g大豆木瓜蛋白酶水解物„„„„„„„„„3.0g氯化钠„„„„„„5.0g磷酸氢二钾„„„„„2.5g葡萄糖/无水葡萄糖„„„„„„„2.5g/2.3g目的支持广泛微生物的生长,包括需氧菌专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是需氧菌）用于培养真菌支持广泛微生物的生长,包括需氧菌、专性和兼性厌氧菌、真菌（主要是需氧菌）培养条件14天于30-35°C及20-25°C14天于20-25°C14天于30-35°C及20-25°C2010年版2015年版金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种到营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物接种到胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养基黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基菌液障制备赴用培法养基毁的修鞋订2010年版2015年版硫乙醇酸盐流体培养基：金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基：金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌生孢梭菌改良马丁培养基：白色念珠菌黑曲霉胰酪大豆胨液体培养基：枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉培养阳基灵友敏度俗检查无菌踪蝶检查凤方法秩的整罢合以20窑10年版魄药典玻二部克为基沿础，侨整合奔保留激了生质物制届品无鱼菌检插查法从的特煌点，代在检回验数芳量、决检验艰量、鹊阳性棉对照蜂、培共养温昼度方积面互梅相兼狭顾。生物览制品太的无友菌检弦查中刻硫乙步醇酸遍盐流童体培民养基扯为双洞份，迫分别洪置30～35℃、20～25训℃两个献温度牌培养鞋。US买P/镇EP戏/B碍P/寻JP展/I矮CH无菌尿检查纤法中病对生遵物制萄品均污没有芝作出支特殊后规定咳。无菌敬检查街方法期的主心要修陪订“方砌法验业证试夸验”此修订再为“价方法湿适用顶性试锋验”“若锤该产作品的药组分袍或原暴检验数条件岸发生浙改变集时，拳检验描方法益应重意新验慨证”雅修订还为“这若检豪验程瞒序或靠产品忆发生奖变化杯可能库影响除检验贿结果奇时，谁应重涝新进汁行方杰法适鄙用性测试验困。”“方较法适诉用性打试验竹”培沙养时艺间由归“3～5天”苹修订罪为不匀得超阵过5天。2010年版2015年版硫乙醇酸盐流体培养基接种小于100cfu的菌液：金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基接种小于100cfu的菌液：金黄色葡萄球菌大肠埃希菌生孢梭菌改良马丁培养基接种小于100cfu的菌液：白色念珠菌黑曲霉胰酪大豆胨液体培养基接种小于100cfu的菌液：枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉方法肥适用侨性试赴验的退修订检验戴数量跨：是霉指一焦次试穴验所湿用供盈试品全最小隐包装鸣容器谣的数先量。绒成品济每亚腐批均店应进梳行无固菌检片查。20滩15版药津典四逝部通名则11见01表2，上熟市抽乖验样蝴品的商最少纯检验余数量吧，除蛮抗生拦素和火血液龟制品株外，V≥10病0m施l液体市制剂溪的最或少检有验数数量由20婚10年版岩药典6瓶/支修袄订为10瓶/支。筋即所船有上耗市抽拉验样派品除遮抗生晓素和氏血液蛋制品成外的悄最少垫检验疾数量捧为10瓶/支。橡增加异了供砌试品掌检验舱数量绪。2010年版2015年版硫乙醇酸盐流体培养基：4种金黄色葡萄球菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基：3种金黄色葡萄球菌大肠埃希菌生孢梭菌改良马丁培养基：2种白色念珠菌黑曲霉胰酪大豆胨液体培养基：3种枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉方法宅适用金性试驼验用留菌株无菌痰检查冈法的跨方法顽适用奏性试语验菌液训制备丸要点新鲜呀培养笔物，桂混匀家。每一宗稀释创剂更秒换吸习管。生孢旷梭菌尊可以畏用硫笔乙醇凡酸盐雕流体周培养辞基计树数，炎一般16～18筹h内观取察。菌液创制备硬要点采用告琼脂砖斜面站上的诉培养忽物制岩备菌临液时美，尽浪量使羡菌苔权分散颠。黑曲什霉可灿制成傅稳定玻的孢宝子悬旅液保宜存在2～8℃。对于合同一调份试蚕验菌概培养惩物，沫采用务相同慎的稀欲释步脚骤，海不同替的实稀验人败员对究菌数极的测抵定结进果可燥能存希在较晓大的踪蝶差异艇。铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]大肠埃希菌[CMCC(B)44102]金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]生孢梭菌[CMCC(B)64941]枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]G-杆菌G+球菌酵母菌霉菌兼性需氧菌专性厌氧菌专性需氧菌白色念珠菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)98003]G+芽孢右杆菌大肠信埃希暂菌、摇金黄矛色葡替萄球舰菌、饿铜绿盖假单亮胞菌削需氧例层厌传氧层柜均生难长。枯草搂芽孢聪杆菌执仅在摊需氧遍层生曾长。生孢寄梭菌枯仅在本厌氧郑层生对长。取样券量的浇确定例：呀批蜘生产夫量>5折00个的育规格速为1m耻l的注沫射液享，表1规定趁接种泻每种龙培养牵基的放最少包检验欢数量渴为20个或2％（监取较屿少者抚），萍表3规定腔全量饱接种迁。直接韵接种搜法勾每吉管培猫养基盗接种定样品程的量×6验证煌（一免次）薄膜降过滤脚法哨每谋株菌20瓶，6株菌12攀0瓶直接照接种巴法40瓶+阳性无菌乳检查薄膜秤过滤栗法40瓶+单20瓶（养阳性城）=6单0瓶方法匪适用朗性试两验结辟果的肾判断灭：与对带照管俘比较昼，如串含供妈试品模的各灶试验艺管的芹实验遗菌均描生长炊良好息，可廉照此臂检查殿法和哭检查翅条件企进行鱼供试亮品的翁无菌弓检查脚。如含番供试挖品的源任一挖试验既管的净实验仁菌生素长微索弱、岁缓慢坊或不散生长猴，可志采用谱增加持冲洗么量、罪增加裁培养然基用铸量、足使用火中和卖剂、貌更换松滤器卵品种怜等方贼法，高重新叶进行央方法词验证球。无菌荣检查唤法的舟注意维事项培养护基的夹要求推：灵敏疮度检芬查符慢合规题定。硫乙议醇酸争盐流麦体培稳养基蚁氧化沿层：接种毕前：充培养吨基氧干化层它的高库度不检超过讽培养狠基深升度的1/锅5，否遵则须港经10完0℃水浴旱加热幕至粉棵红色侄消失关（不徒超过20分钟矿），槽迅速萄冷却为，只演限加删热一豆次，犁并防宾止过描程中赵污染芳。培养协后：推装量伯与容揭器高混度的累比例灰应符摆合培贪养结溪束后臂培养棵基氧蜂化层拿不超晌过培碌养基乖的1/柴2。检验送方法族的选纠择薄膜猴过滤赌法：喝一般挠采用移封闭根式滤器舞。只要拐供试景品性崇质允培许，应采驻用薄谦膜过菜滤法散。直接派接种戒法：井适用拴于无陈法用薄膜抱过滤店法进隔行实脆验的死品种绸。供试系品无芬菌检访查所爪采用塘的检劝查方潮法和糖检验叼条件懒应与话方法勇适用咬性试员验确薄认的掠方法耽相同锯。无菌常试验那过程示中，烧若需扇使用拌表面斤活性广剂、川灭活语剂、树中和势剂等新试剂庄，应策证明狭其有恰效性初，且旬对微薪生物峡无毒威性。常用菊中和甲剂比呆例0.义1％大绝豆卵版磷脂0.浮1~酸1％吐糟温80卵磷签脂、贩吐温80及L－组效胺酸氧用于拔中和镇醛类访及酚摊类化轨合物卵磷包脂及绘吐温80中和仅季铵尸盐卵磷播脂中嘱和氯额己定吐温80中和伯双三表氯酚谋及汞英化合萄物薄膜手过滤灭法水溶居性供鹊试液般过滤屿前应帅先将毁少量晚的冲则洗液读过滤促以润苦湿滤屯膜。油类帖供试即品，财其滤匀膜和月过滤康器在括使用竭前应头充分版干燥换。为发谎挥滤握膜的族最大就过滤矿效率熟，应块注意英保持赴供试锁品溶酿液及魂冲洗毕液覆布盖整躬个滤兆膜表很面。供试健液经通薄膜嫩过滤搜后，划若需芽要用密冲洗恰液冲锈洗滤悠膜，冷每张林滤膜腾每次烟冲洗仇量一伴般为震10赚0m夫l，弄且总梁冲洗取量不津得超伪过1巩00财0m旷l，粥以避喂免滤猎膜上哗的微祸生物正受损孤伤。直接鄙接种寄法除另键有规窜定外膛，每飞个容颤器中面培养视基的套用量降应符签合接宗种的咸供试桂品体伶积不跑得大而于培泪养基武体积模的1匆0%浆，同彻时，历硫乙拒醇酸骆盐流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