细胞凋亡及机制检测

细胞(xìbāo)凋亡（科普诗）

apoptosis似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，逼细胞步步走向(zǒuxiàng)生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡;第一页，共七十二页。精选ppt危难中的细胞啊，你沉稳不乱，DNA片片切割，化云梯直通天堂；细胞体分团相聚，把生命的凝重浓集在小体上；分别了朝夕相处的伙伴，再见了快乐美好的时光；这一切的一切又融入临近(línjìn)的胞体，腾出的空间再写生命的篇章。

第二页，共七十二页。精选ppt第三页，共七十二页。精选ppt第四页，共七十二页。精选ppt

典型的凋亡小体（apoposisboby）：由透亮空泡和不透光的浓密(nóngmì)的核碎片两部分组成。第五页，共七十二页。精选ppt第六页，共七十二页。精选ppt第七页，共七十二页。精选ppt

坏死凋亡1.性质病理性,非特异性生理性或病理性，特异性2.诱导因素强烈病理性刺激,随机发生生理性或较弱病理性刺激，非随机发生3.生化特点被动过程,无新蛋白合成,不耗能耗能的主动过程，有新蛋白合成4.形态变化细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩,膜可发泡成芽,形成凋亡小体5.DNA电泳弥散性降解，电泳呈均一DNA片状DNA片段化（180-120bp）,电泳呈“梯”状条带6.炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应7.凋亡小体无有8.基因调控无有细胞凋亡与坏死(huàisǐ)的比较第八页，共七十二页。精选ppt2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在细胞(xìbāo)程序性死亡方面的研究获诺贝尔生理与医学奖。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston

第九页，共七十二页。精选ppt细胞凋亡与疾病发生(fāshēng)机制的

新认识1.该“死”的细胞（如肿瘤细胞、自身反应性免疫细胞）未死，是造成肿瘤、自身免疫性疾病的主要发病机制之一。——细胞凋亡不足2.不该(bùɡāi)“死”的细胞（如神经元、心肌细胞）死了，这与老年性痴呆、心肌缺血/再灌注损伤等发病有关。——细胞凋亡过度第十页，共七十二页。精选ppt胸腺细胞(xìbāo)正常(zhèngcháng)凋亡(diāowánɡ)第十一页，共七十二页。精选ppt胸腺细胞(xìbāo)正常(zhèngcháng)凋亡(diāowánɡ)第十二页，共七十二页。精选ppt细胞(xìbāo)凋亡的过程1.凋亡信号转导2.凋亡基因(jīyīn)激活3.细胞凋亡的执行4.凋亡细胞的清除第十三页，共七十二页。精选ppt凋亡(diāowánɡ)过程及分期

诱导期执行期消亡期

凋亡诱导因素受体cAMPCa2+神经酰胺死亡信号凋亡相关基因激活Dnase激活(jīhuó)Capases激活巨噬细胞吞噬细胞凋亡(diāowánɡ)细胞第十四页，共七十二页。精选ppt细胞(xìbāo)凋亡的生化改变1.DNA的片段化“梯”状条带2.内源性核酸内切酶激活及其作用(zuòyòng)3.凋亡蛋白酶（caspases）的激活及其作用第十五页，共七十二页。精选ppt1.DNA的片段化“梯”状条带为细胞凋亡(diāowánɡ)主要特征①几乎所有凋亡细胞均有核小体间的裂解，导致DNA的断裂；②DNA降解过程的特异性：不伴有组蛋白和其它(qítā)核蛋白的降解；③染色质在核小体间的裂解是凋亡细胞和形态改变的基础；④DNAfragmentation是凋亡的“goldenmarker”。第十六页，共七十二页。精选ppt第十七页，共七十二页。精选ppt2.内源性核酸(hésuān)内切酶激活及其作用由一系列胞内信号转导环节激活(jīhuó)，执行染色质DNA切割第十八页，共七十二页。精选ppt3.

Caspase9激活，需要通过CARD（caspase-recruitmentdomain)、Apaf-1、细胞色素c、ATP等多个因子的参与

Caspases在凋亡(diāowánɡ)中的主要作用1.灭活细胞(xìbāo)凋亡的抑制物（如Bcl-2）；2.水解细胞的蛋白质结构，导致细胞解体，形成凋亡小体（apoposisboby）；3.在凋亡级联反应中水解相关活性蛋白，使该蛋白获得或丧失某种生物学功能第十九页，共七十二页。精选ppt细胞凋亡(diāowánɡ)的调控（一）细胞凋亡(diāowánɡ)相关因素1.诱导性因素2.抑制性因素

(二)细胞凋亡信号的转导第二十页，共七十二页。精选ppt1.细胞凋亡(diāowánɡ)的诱导因素.生理活性因子：TNF家族(Fas-L,TNF)、TGF、神经递质(谷氨酸、多巴胺)、生长因子撤退、GC等.损伤相关因子：热休克、病毒感染、自由基、癌基因、抑癌基因、放射线等.化疗药物(yàowù).毒素：乙醇、β-淀粉样肽第二十一页，共七十二页。精选ppt2.细胞凋亡的抑制(yìzhì)因素.凋亡(diāowánɡ)相关基因的抑制作用：p53、bcl-2、bcl-XL等。.生理性抑制剂：生长因子、细胞外基质、锌、雄激素、雌激素等.病毒基因：腺病毒E1B、杆状病毒p35、棒状病毒IAP、牛痘病毒CrmA、EBVBHRF1等.药物：Calpain抑制剂、caspases抑制剂、促癌剂、佛波豆蔻乙脂(PMA)等第二十二页，共七十二页。精选ppt(二)细胞凋亡信号的转导

凋亡信号转导系统(xìtǒng)特点①多样性：不同种类的细胞系统不同②偶联性：与增殖(zēngzhí)分化的信号系统交叉偶联③同一性：多因素，共用同一系统触发④多途性：同一诱导因素启动多条信号转导途径第二十三页，共七十二页。精选ppt㈡细胞(xìbāo)凋亡信号的转导诱导(yòudǎo)信号cellR神经酰胺多途径(tújìng)RSAPK/JNKP53基因NF-kB,JNK/AP-1途径激活baxor下调bcl-2ROSmtDNA第二十四页，共七十二页。精选ppt㈢细胞(xìbāo)凋亡相关基因抑制凋亡基因(jīyīn)：bcl-2促进凋亡基因：fas，P53双向调控基因：c-myc，bclx研究较多的有c-myc、bcl-2、p53、Ice、Fas/APO-1等。第二十五页，共七十二页。精选ppt1.c-mycc-myc诱导细胞增殖，也能诱导细胞凋亡。当生长因子存在(cúnzài)，bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。第二十六页，共七十二页。精选ppt第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，存在于线粒体外膜、核膜及部分(bùfen)内质网中。bcl-2相当于线虫的ced9。Bcl-2家族可分为两类，一类是抗凋亡的，如：Bcl-2；一类是促进凋亡的，如：Bax、Bad、Bid，以二聚体形体发挥作用。2.bcl-2第二十七页，共七十二页。精选pptBcl-2抗凋亡(diāowánɡ)机制①直接(zhíjiē)的抗氧化②抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质③抑制促凋亡的Bax，Bak细胞毒作用④抑制Caspases激活⑤维持细胞钙稳态第二十八页，共七十二页。精选ppt3.fasfas又称作APO-1或CD95，属TNF受体和NGF受体家族。对细胞凋亡有促进作用基因产物(chǎnwù)为45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。第二十九页，共七十二页。精选ppt与线虫ced-3同源，又称为Caspase。ICE是一种半胱氨酸蛋白酶，在人类，ICE家族至少有11个成员，每一成员均含有(hányǒu)与底物结合及催化的保守序列，识别位点在Asp之后，故又称Caspases。

启动子Caspases：Caspases8、9和10效应子Caspases：Caspases3、6、74.ICE蛋白酶家族(jiāzú)第三十页，共七十二页。精选ppt5.Apaf-1与线虫的ced-4同源；在线粒体参与的凋亡途径中发挥作用；能激活Caspase3，这一过程(guòchéng)需要细胞色素c和Caspase9的参与。第三十一页，共七十二页。精选ppt6.p53

磷酸化p53使细胞处于G1期，必要时诱导(yòudǎo)细胞凋亡。p21CDKRB不被磷酸化G1DNA损伤p53并磷酸化Bax,BclapoptosisGadd45DNA修复野生型P53基因具有诱导细胞(xìbāo)凋亡的功能——“分子警察”；第三十二页，共七十二页。精选ppt细胞(xìbāo)凋亡发生机制（一）氧化损伤(sǔnshāng)（二）钙稳态失衡(三)线粒体损伤第三十三页，共七十二页。精选ppt（一）氧化损伤(sǔnshāng)机制氧自由基可破坏机体正常的氧化/还原的动态平衡，造成生物大分子的氧化损伤，干扰正常的生命活动，形成严重的氧化应激状态——后果：诱导(yòudǎo)细胞凋亡。第三十四页，共七十二页。精选ppt氧化应激引起细胞凋亡的可能(kěnéng)机制1.氧自由基引起的DNA损伤可激活P53基因引起细胞凋亡。2.氧自由基引起的DNA损伤可活化多聚ADP核糖合成酶，引起NAD快速耗竭，ATP大量消耗，引发细胞凋亡。3.氧自由在攻击(gōngjī)细胞膜上的不饱和脂肪酸，通过脂质过氧化作用直接造成细胞膜的损伤可诱导细胞凋亡；此外细胞膜上不饱和脂肪酸（如：花生四烯酸）的氧化产物过氧羟基24碳四烯酸有很强的诱发细胞凋亡的作用。第三十五页，共七十二页。精选ppt氧化应激引起(yǐnqǐ)细胞凋亡的可能机制（续）4.氧化应激可激活Ca2+/Mg2+依赖的DNase，也可产生膜的发泡现象。5.氧化应激引起细胞膜结构的破坏，可改变细胞膜的通透性使Ca2+内流增加，诱导细胞凋亡。自由基对线粒体膜的损害导致其通透性和膜电位的变化也可诱导细胞凋亡。6.氧化应激可活化核转录因子NF-κB、AP-1，可加速(jiāsù)细胞凋亡相关的一些基因的表达，诱发细胞凋亡。第三十六页，共七十二页。精选ppt（二）钙稳态失衡引起细胞凋亡的可能(kěnéng)机制1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶(DNase)，降解DNA链；2.激活谷氨酰胺转移酶，催化细胞内肽链间的酰基转移，在肽链间形成共价键，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成；3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接(liánjiē)区内的酶切位点，有利于DNA内切酶切割DNA。第三十七页，共七十二页。精选ppt(三)线粒体损伤(sǔnshāng)第三十八页，共七十二页。精选ppt第三十九页，共七十二页。精选ppt细胞凋亡的恶性网络(wǎngluò)假说线粒体Δ

Ψm↓PTP开放(kāifàng)Apaf+Cyt.C

AIFCaspase抑制剂+Caspase9酶原(méiyuán)Caspase-9Caspase3酶原Caspase-3蛋白质水解无活性核酸内切酶内切酶激活DNA断裂++–+–Bcl-2––Ca2+apoptosis？第四十页，共七十二页。精选ppt氧化(yǎnghuà)损伤钙稳态失衡(shīhénɡ)线粒体损伤(sǔnshāng)恶性网络假说(deleteriousnetworkhypothesis)

细胞凋亡Δ

Ψm↓

AIF，ApafPTPopen第四十一页，共七十二页。精选ppt细胞(xìbāo)凋亡的生物学意义1.发育从低等动物到高等动物的发育，都存在着程序性细胞死亡的现象。2.免疫系统淋巴细胞发育分化成熟过程中，始终(shǐzhōng)伴随着细胞凋亡。3.衰老细胞凋亡与许多年龄相关疾病有直接或间接的联系。4.损伤与修复5.肿瘤发生细胞增殖与死亡的速度平衡失调。6.病毒致病病毒表达抗凋亡蛋白。第四十二页，共七十二页。精选pptHutchinson-Gilfordsyndrome

第四十三页，共七十二页。精选ppt第四十四页，共七十二页。精选ppt细胞(xìbāo)凋亡与疾病（一）细胞(xìbāo)凋亡不足1.肿瘤2.自身免疫病第四十五页，共七十二页。精选ppt1.凋亡与恶性肿瘤

肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，还与凋亡障碍(zhàngài)有关。Oncogenes“anti-apoptic”genesCelldivisioncelldeath肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞的凋亡第四十六页，共七十二页。精选ppt2.凋亡(diāowánɡ)与免疫系统功能障碍凋亡对免疫系统功能有重要调节作用淋巴细胞：在发育过程中有凋亡发生；在晚期，当与抗原相互作用时亦发生凋亡。胸腺发育过程中的自然凋亡过程第四十七页，共七十二页。精选ppt（二）细胞(xìbāo)凋亡过度1.心血管疾病（1）心肌缺血与缺血-再灌注(guànzhù)损伤（2）心力衰竭第四十八页，共七十二页。精选ppt（1）心肌缺血和再灌注损伤

心肌缺血再灌注后可引起心肌细胞的凋亡，由于心肌组织中吞噬细胞(tūnshìxìbāo)数量有限，故而凋亡细胞可以激发性引起炎性反应，招引中性粒细胞浸润，进而导致心肌组织坏死（心肌梗塞）。第四十九页，共七十二页。精选ppt(2)凋亡与心脏病

心脏传导障碍和心律失常心脏传导系统在胚胎早期就已形成。新生儿窦房结主要有大量起搏细胞(xìbāo)（P细胞(xìbāo)）和少量胶原组成，而成人则为少量P细胞(xìbāo)和大量胶原构成，可能是P细胞(xìbāo)凋亡的结果。因此P细胞(xìbāo)凋亡不足或过度均可引起心律失常。第五十页，共七十二页。精选ppt2.神经元退性疾病（1）阿尔茨海默病(AD)（2）帕金森病（3）多发性硬化症第五十一页，共七十二页。精选ppt(1)凋亡与神经退行性病变

神经元是non-proliferating,long-lived,terminallydifferentiatedcell。神经元等非增殖细胞发生凋亡的意义：1、避免细胞重新进入细胞周期，特别(tèbié)是遇到致转化刺激信号时。如向终末分化的细胞中转染oncogene可引起细胞凋亡，而非增殖。第五十二页，共七十二页。精选ppt(2)为了器官(qìguān)生存的需要Adeletedcellismoreadvantageousthanadamagedcell,evenwhenthecellisirreplaceable.Thisisanalogoustowhatisfrequentlyreferredtoas“betterdeadthanwrong”fordividingcell第五十三页，共七十二页。精选ppt3.病毒感染人免疫(miǎnyì)缺陷病毒（HIV）感染引起的AIDS第五十四页，共七十二页。精选ppt(凋亡与免疫缺陷性疾病)典型例子是AIDS1.HIV-1感染后可引起CD4+T淋巴细胞的凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体gp120介导。2.AIDS患者外周血淋巴细胞Fas/Apo水平明显提高，可迅速诱导细胞凋亡。

由此，通过控制凋亡过程(guòchéng)是否可以预防或延缓AIDS的进展。第五十五页，共七十二页。精选ppt（三）细胞凋亡(diāowánɡ)不足与

过度并存动脉粥样硬化(yìnghuà)即属于这种情况，对内皮细胞而言是凋亡过度，对平滑肌细胞来说则是凋亡不足第五十六页，共七十二页。精选ppt细胞凋亡(diāowánɡ)在疾病防治中的意义1.合理利用凋亡相关因素(yīnsù)2.干预凋亡信号转导3.调节凋亡相关基因4.控制凋亡相关的酶学机制5.防止线粒体跨膜电位的下降第五十七页，共七十二页。精选ppt1.合理利用凋亡(diāowánɡ)相关因素抑凋亡：NGF→老年性痴呆急性T细胞白血病：低剂量放射线、TNFα

促凋亡：局部肿瘤热疗；高温43℃、30min前列腺癌：去势治疗2.干预凋亡信号转导FAS/FASL信号系统：阿霉素刺激SPP（神经酰胺信号系统的代谢产物）：转导增殖信号，拮抗凋亡→AIDS，AD第五十八页，共七十二页。精选ppt3.调节凋亡相关基因野生型P53基因转染4.控制凋亡相关的酶核酸内切酶：Ca2+/Mg2+依赖性Ca2+

Mg2+激活；Zn2+抑制Caspases:Ca2+直接或间接激活5.防止线粒体跨膜电位的下降环胞霉素A(cyclosporinA,免疫抑制剂）阻抑(zǔyì)ΔΨm↓，其衍生物无免疫抑制作用，但有稳定ΔΨm↓

第五十九页，共七十二页。精选ppt细胞(xìbāo)凋亡的检测

随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。1.形态学检测2.DNA降解分析(fēnxī)3.凋亡酶学分析4.凋亡相关蛋白分析5.流式细胞分析第六十页，共七十二页。精选ppt一．细胞凋亡(diāowánɡ)的形态学分析细胞(xìbāo)凋亡的形态学变化主要表现为：细胞(xìbāo)皱缩(cellshrinkage)，失去细胞(xìbāo)连接(celljunction)，微绒毛(microvilli)消失，发泡(blebbing)，染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的新月状体(crescents)，形成凋亡小体(apoptoticbody)等。第六十一页，共七十二页。精选ppt细胞凋亡(diāowánɡ)的形态学检测方法检测方法可鉴定凋亡细胞特征光学显微镜相差显微镜透射电镜

聚焦激光扫描电镜扫描电镜流式细胞仪缩时摄影术细胞体积缩小、核浓缩、细胞周围透明圈细胞发泡、凋亡小体微绒毛消失、染色质沿核膜分布、新月体状核、凋亡小体凋亡细胞内固缩染色质及核碎片定位细胞膜表面泡状鼓起低前向散射光(FSC)、高侧向散射光(SSC)凋亡细胞的形成过程第六十二页，共七十二页。精选ppt二.DNA降解(jiànɡjiě)分析DNA降解过程的特点：1.发生于凋亡早期(zǎoqī)，由内源性核酸内切酶激活引起2.DNA在核小体连接部位断裂，产生180－200bp为最小单位的单体或寡聚体片断3.DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡小体第六十三页，共七十二页。精选ppt

(一)DNA凝胶电泳原理：凋亡细胞降解产生一系列规则的DNA片断，其电泳结果呈典型的“梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后坏死细胞的DNA分解是随机的，产生的碎片分子量大小不一，在电泳时形成“涂片状”(smear)。普通琼脂糖凝胶电泳、Southernblotting、放射自显影(xiǎnyǐng)(32PdATP或32PdCTP连接到DNA片断的3’端)第六十四页，共七十二页。精选ppt(二)原位标记法TUNEL(TdTmediateddUTPnick

endlabeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记技术。原理：在TdT的作用下，带有标记物的dUTP被连接在断裂DNA3’末端，然后通过相应的方法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生(fāshēng)。应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、培养细胞、组织中分离的细胞 第六十五页，共七十二页。精选ppt(三)ELISA法

原理(yuánlǐ)：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结合，再加入抗-DNA片断-POD复合物，与核小体中的DNA片断结合，最后加入POD显色底物，以酶标仪测定光密度以进行定量分析。第六十六页，共七十二页。精选ppt三.凋亡(diāowánɡ)酶学分析1.内切核酸酶(endonuclease,DNase)

种类(zhǒnglèi)：DNaseⅠ（内质网、高尔基体),DNaseⅡ（溶酶体、胞核)，NUC18（胞核，胸腺细胞中)等

作用：使DNA断裂成180－200bp或其倍数的片断

激活机制：CAD(caspase-activateDNase)ICAD(inhibtorofCAD)