HIV1包膜糖蛋白gp120s在大肠杆菌中的表达纯化和初步应用

HIV1包膜糖蛋白gp120s在大肠杆菌中的表达纯化和初步应用英文除需净第一部分英文缩略语表缩略语英文全称中文全称AmPAmP诲Uin氨羊青霉素bpBasepair碱基对BSABovineserumalbuπun牛血清白蛋白CDNACamplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸DABDiaJnitiQbenzidine二氮基联茶胺EREthidiuoibɪŋmide漠化乙锭SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠ELISAEnzyme-Jinkedimmuιx>sorbentassay醐联免疫吸附试验MWMolecularweight分子量TEMEDNfNN∖Nfi-tetramethylethylenediamineNNN.N一四甲基乙二胺E.∞liEscherichiacoli大肠杆菌IPTGlsopropylth]0-βBgalaCtOSi加异丙基硫代-BB半乳糖昔kdaKilodaltons千道尔顿LBLuria-BertaiiimediumLuria-Bertani培养基PAGEPolyacrylamidegelClectropHoresis聚丙烯敌胺凝胶电泳PCRPoJymerasechainreaction聚合的链式反应rpmRevolutionperminute每分钟转数PMSFpHe∏ylmefhatπe⅞uIfb∏y1∏uo∏de紫甲基横酰敏TrisTns(bydroxymethyl)aπιinome[hane三供甲基腐基甲烷HRPHorseradishperoxidase镰根过氧化物酶ORFOpenreadingframe开放读码框PBSPHospHate-bufferedsaline磷酸缓冲盐溶液摘要■HIV-1包膜糖蛋白gp120s在大肠杆菌中的表达纯化及初步应用中文摘要人类免疫缺陷病毒（HlV）是引起艾滋病的病原体，分为两型：HHl和HIV-3 d戈主要为HlVF它”般的病毒有明显的差别，首先是其基因组相对复杂，编码更多的蛋白质来调控病毒潜伏.激活，转录与复制等过程，其次是它在宿主个体内变异迅速•鉴于HIV-I包膜糖蛋白印120是HrVJ的主要抗原成分，是检测HtV抗体诊断试剂氤的重要组成成分，也是制备抗初2。单克隆抗体必需的免疫原,应用广泛，意义十分重大.本研究利用分子生物学手段‘将即12°的部分编码基因'命名为即12。G重组到大肠杆菌的表达囊体中，并成功地进行了蛋白表达。表外膜糖蛋白gpl20s的编码基因的克隆和在大肠杆菌中的表达B用聚合酶捱式反应 ?PCR从HΓV∙I型国际标准株PHXB泰即160的基因序列中扩增出糖蛋白片段基因537⅛b插入质粒pET32a中构成重组表达质粒pEI32a-gpl20s,将其转化大肠杆菌BL2I后获得了高效表达，经IPTG透导衰达后，SDS和免疫印迹分析其表达产物证实蛋白得到衰达且主要存在于包涵体中，凝胶扫描成像分折证实其表达最占菌体总蛋白的45.35%,在逶导4个小时蛋白表达量最大，以包涵体的形式表达.包涵体经过洗涤、溶解、复性和过操柱后，其纯度达到85%,表明已获得高纯度的目的蛋白,用纯化的重组即1式蛋白作为包被杭原，间接ELISA对5份已知HlV阳性血清中的gpl20抗体进行检测，结果表明该纯化蛋白具有一定的抗原活性，能特异性地与HlV抗体反应.本研究在大题杆菌中成功表达了印120s蛋白，为进一步发展HlV诊断试剂.研究AIDS亚单位疫苗奠定了一定的基础，为研究HrV主要抗原蛋白的性质提供可能，也为制备HrV-I的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础.美键词：人类免疫缺陷病毒1型Igp120s;基因克隆表达；蛋白纯化.⅛要Expression,purιficatinnandprimaryapplicationofHIV-Igpl20sAbstractHUmnImmunodeficiencyVirυs(HlV)isthepathogenthatcausesacquiredtanunodefici^ySyntkOmU⅛human.ItCanbecategorizedintotwotypes：HIV-IandHIV3HΓV-1kthemainlype.It⅛differentfiŋmotherYimSeSforitscomplicatedgenomerelatedtothehte∏cy,activat!Q[i,transcriptionandreplicationandforitsvariationinhostcdlsτE∏vdopeglycoprotdπsgpl20isthemainantigenofHIV-IandimportantcomponentOf由岬IOSiShtsfbτdetectingHyVantibodies.Bcanbeusedtoproducegpl20monoclonalantibodies.Consideringitsimportanceinapplication^wehavetriedtoChOoSepartofthegpl20gene(namedgpl20s}toexpressinE.coli..DNAfragment537bpwasobtainedbyPCK&omtheplasmidpHXB2-gp160andSnStnICtedintoPlaSmidpET32a.TherecombinantPlaSmidwastransf⅛medintoEsliBL21(DE3)plys∙AftertheinductionbyIPTGtheexpressedproteinwasdetectedbySDSandWesternblot.Itshowedthatthe40KdfusionprateinwasJlIaiMyexpressedininclusionbodieswithanamountthataccountstoatleast4335%ofallExobproteins.WeObuinedVCTypuregpl20⅛PWuiaS(35%Jbywashing,dissolvmgandre期dingtheinclusionbodies.Primaryapplicationsofgpl120indetectingantibodiesbyindirectELISA⅛HΓVrshowedthatithavegoodantigen.Inthisstudywetriedtoexpressgp!20sinE,coli,andsucceededinexpressinggpl20smExoli.ThisstudyhaslaidsamegroundwoɪkforfurtherresearchesanddevelopmentofHIVdMg∏8i5reagentsandSubUnitVMCinCSfcrAIDS+I传alsoimportantforstudyingthepropertiesofthemainantigensQfHlVrKeywords；Humanlmmunode∩ciE∏cyVirustypel(HIV-I);gpll(h;geneclone;proteinexpressionandpurification.第一章文献琮逑■—第一章文献综述LHIV研究进展 为1.1艾滋病流行趋势t参得性免及缺陷综合症(MquiredimmunodefickncySyTIdlmnGArDS)简称艾滋病，是1981年发现的一种病毒性传染病，主要表现为机会性感染和选择性恶性肿痛.该传染病的致病因子是人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvinj^HIV).自从19SI年美国报道首例AlDS以来，国际社会在防治AlDS方面做出了不懈的努力,但AlDS在全球范围内仍没有得到控制，正在继续蔓延•据2005年麟合国艾滋病规划署和世界卫生组织共同发表的《全球艾滋病现状报告书》称，2005年新增感染人数为49。万，其中成人达到420万,到年底，艾滋病病毒感染人数将达到在。瓦同时，2005年有31。万人因艾滋病死亡,儿童死亡人数达到57万2005年死亡人数相当于美国西雅图人口口从不同地区来看，除大洋洲、中西欧和北美，其它地区都呈上升趋势・死亡人数除加勒比海、中西欧和北美地区∙都在不断增加，尤其在亚洲，感染者在急剧上升.亚洲地区感染人数排在沙哈拉以南非洲地区之后的第二位，达到930万人•南亚和东南亚地区的感染人数为？40万,其中，印度感染者最多,达到51。万.东亚地区2。。5年有87万人感染,比2003年底增加在亚洲，每7名感染者中有一人接种抗逆转录病电据我国卫生部最新公布的数字，我国AlDS流行正处于快速增长期,HIV感染者人数正以每年30%以上的速度递增,到2008年上半年止,中国艾滋病病毒感染总人数已增长到近IoO万，成为世界上艾滋病感染率增长最快的国家之一，艾滋病正从高危人群向普通人群迅速蔓延.目前我国HrV感染者占总人口的比例虽然很低，但感染人数在亚洲位居第二位,在全球居第十四位.更有专家预计说，如不及时采取积极有效措施，到2010年我国的HlV感染者将达到1000万.一项权戚报告显示，在未来10年.艾滋病流行造成的损失将不少于225亿元.由于AIDS为爆发，加上至今没有有效的治疔药物，以及读病对生命、财富、劳动力，资源的长期无限制敏耗.具有巨大的危害性。研究人员预测，如果不进行预防，到2010年全球将有7500万人受到感染，到2020年息共将有1亿人死于AtDS,因此AIDS第一章文献踪述的大规模爆发对社会乃至一个民族可能是毁灭性的，它将使整个国家荒芜，整个地区动荡不安，这样的例子在非洲一些国家已经初露端倪。]2HIV的分型≡有HIV-I和HIV-2两型口色两型氨基酸序列的同源性为40%-60%,几乎所有病例感染的都是HlV-1。HlV-I又可分为M群（包括A-K亚型）和。群[叫。群和M群有55%70⅞的同源性.美国9&%以上的HIV-I感染是由于B亚型造成的“HIV-2最早在西非发现闾，与HIV-I相比，HIV-2的传播效率较低（感染早期的传播效率比HIV-1低5-8倍，并且很少发生垂直传播）。HIV∙2感染病毒载量常较低、CD4细胞下降速率和临床进程较慢.13HIV的分子生物学特征艾滋病病毒（HIV）颗粒呈球形，直径90rnn〜13OnnU病毒的核心呈中空铤形，由两条相同的单链RNA链、逆转录酶和蛋白质组成.核心之外为病毒衣壳,呈20面体立体对称，含有核衣壳蛋白质。最外层为包膜，包膜上的糖蛋白有刺突状结构，是HIV与宿主细胞受体结合位点和主要的中和位点（图1.1‰envgpi20βπvgp41ggp179agp24RHAHUnW)IjnrnLInCdeficiencyViius-Structure图LI艾滋病病毒模式图HIV基因组为单股正链RNA二倍体，每条RNA链长约9N⅛,两条链的5,端借助氢键形成二聚体，与其他逆转录病毒相同，HIV的基因结构从5,端到3,端依次为5τLTR-gag-pol-env-3,LTR,5,端有帽状结构m7G5ppp5GτnpNp*3,端有POIyA序列-除三个编码结构蛋白的基因gag、pokEnV外∙HlV还有较其他逆转录病毒更多的调节基第一章文献线述因CreguJatorygene)和附加基因(accessorygene)，其编码的的调节蛋白在病毒的整

个感染及复制过程中具有非常重要的作用，目前已发现至少有7种：面、rev,nef,叩八πττΓ91ΘJ-R'polyflSiQhaI-S1IFTRlprimmr_LbindQPPX目UPUi3'UTR-^R*POIyR_5i9na!1Legend：VPI1、VPX和vif（图12）[5,o图L2HIV基因组示意图⑴长未端重复序列HIV基因组两端的长末端重复序列(Isigtermi皿】repeat,LTR)不编码病毒产物，对于病毒基因表达的起始和调节至关重要［可，其上有许多细胞转录因子的结合位点，可分为调节单位、核心转录单位和反式激活效应元件单位(TAR)三个不同的调控功能区QQ)G维基因j即特异性抗原基因,编码分子量为55Kd的前体蛋白(P55》，由未拼接的病毒mRNA表达。P55经病毒蛋白酶切割，由N端至C端形成P17.P24、P15三种蛋白。P17称为基质蛋白(MA),附着于病毒脂质又层膜的内侧，形成毒粒的内膜.起稳定毒粒的作用,P24称及壳蛋白，形成病毒的锥形核.P15进一步被裂解为P9和P7两种核壳蛋白，与病毒的RNA结合.(3*加基因Pol基因编码病毒的逆转录酶(RT)P66和整合酶(IN)P32,由未拼接的病毒mRNA表达口RT由两个亚单位P66和P51构成，其N端完全一致，具DNA聚合瞥活性，而C端由于病毒蛋白酶的不对称切割,使一个亚单位C端的部分氨基酸被切除而失去RNA酶H的功能，另一亚单位C端的RNASiH功能域则未被切除.HIV进行复制时，首先在RT的N端的DNA聚合酶功能区的作用下，以RNA为模板合成互补的DNA,表一二一———二 第 献竺gz_现出逆转录醒活性’然后在P51的协助下'P66C端的RNA酶H功能区降解RNAzDNA双链中的RNA链,表现为RNA酶H活性'最后以此单链DNA为模板,由PG6亚单位合成互补DNA而成双链DNA,表现出DNA聚合酶功能.整合酶能弱将逆转录成的双链DNA整合入宿主染色体口NA,整合过程可分三步『首先由IN在病毒线状平端DNA的3,端由T-T方向切下2个核甘酸,形成CA-OH-3*,同时在宿主DNA双链整合部位上各切开一Sbp的切口，然后在IN的作用下,CA-OHf与宿主DNA切开部位的Si-P形成磷酸二命键，最后整合部位被修补完整.㈤EnV基因EnV基因编码病毒的膜蛋白，由单一拼接的2A进行表达，首先在内质网内合成分子量为88Kd的蛋白质，在向高尔基体的转运过程中被糖基化而成为分子量160Kd⅛160)的包膜糖蛋白前体，糖基化为病毒的传染性所必须.gpl60被蛋白酶切割为一即120和gp4l两部分，gpl2。位于感染细胞和毒粒的表面，称外膜蛋白，其上有5个高变区(Vl-V5)和5个保守区(Cl¢6)P叫高变区中的V3环区是阻断HlV传播的中和抗体结合的主要靶位，gp41镶嵌于病库的脂质双层中,称跨膜蛋白，在病毒感染过程中能够介导病毒脂膜与细胞膜的融合口gp120与gp41的N端以非共价键结合，当HrV感染T淋巴细胞或巨噬细胞时，印12。首先与细胞表面的84分子结合，导致空间构象发生改变，使刎1与细胞膜充分接触而发生病毒与细胞膜的融合.(S)Tat基因Tat基因由两个外显子构成，编码HIV复制和基因表达所必须的反式激活蛋内(transactivator,Tat),又称反式激活因子Ctπms-activatingfactor),能够增强病毒复制的起始,促进mKNA的转录和翻译.Tat与HΓVRNA5,端LTR结合后能嘉极大地提高HiV基因的转录水平,另外，域可能还具有转录延伸因子的作用,延长mRNA的转录.(6)ReV基因Rev基因由两个外显子组成，分别编码25个氨基酸和91个氨基酸的版段，由完全拼接的mRNA进行表达，两个肽段结合形成19Kd(P19)的病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulaκ>rofexpressionofvirionprotein,Rev)在胞质内合成后由其上的核定位信号(nuclearIocaliwatiQiisignal,NLS)介导进入核内聚集于核仁口Rev蛋白是HΓV复制非图一章X•综述 — —常重要的一个反式激活因子，能够促进HlV的基因转录由早期向晚期转变，即由调节蛋白基因的转录向结构蛋白基因的转录进行转变・因此，ReY蛋白对HIV的调节基因具有负调控作用，而对病毒结构基因和附加基因具有正调控作用.另外，ReV与其应答元件(Revrespansiveelement,RRE)的结合还可促进未拼接或未完全拼接的病毒mRNA由胞核向胞浆运输.17)Nef基因NCf基因由单一外显子构成，编码27k6的甲基化蛋白.Na蛋白是HrV复制过程中的负调节因子(StiVeregulationfactor),具多种功除既可进行正调节，也可进 取行负调节.能锵增强或减弱病毒的复制,既能激活T细胞，增加病毒感染，又能抑制病毒的超感染[叫](8)其他调节蛋白基因VPr基因编吗病毒蛋白「高度保守・VPr蛋白非HiV复制所必须，能反式激活病 整毒基因的表达，在HIV感染未分裂的细胞时使细胞停留在细胞周期的G2期*另外，VPr基因的存在还可使HIV感染细胞时致细胞病变效应增加.VPU基因编码病毒蛋白》为HIV-I所恃有，VPU蛋白为非HJV复制所必须的双亲 必性膜整合蛋白，能够增强病毒颗粒的组装和释放,介导内质网中CD4分子的快速降解【皿LVif基因编码病毒颗粒感染性因子Cvirioninfectivity⅛ctortVif)，Vif蛋白亦非HIV复制所必须，能够增加病毒颗粒的感染性口叫HIV的传播途径HIV主要通过以下三种途径传播；CD性接触传播,主要为男性同性恋及男女之间的异性性接触，女性同性恋少见.目前男女之间异性传播已成为HIV传播的主要方式.而女性对HiV的易感性比男性高4倍.¢2)通过输血或血制品传播“主要为被HlV污染的注射用具、血液及血液制品,辛 :一章.・文就综述 (3)母婴传播.包括宫内、分娩过程及产后等‹■据美国CDC的调查结果，在W13岁的小儿HIV/AIDS中，70%以上都是在围产期由母亲传播给婴儿的.HIV的生活周期HrV病毒的生活周期如图13所示计HiV的核心进入宿主细胞,RNA逆转录成DNA,即前病毒.前病毒进入细胞核，整合到细胞基因组中。新合成的蛋白被运送到质膜，装配并以出芽方式从细胞中释放出成熟的病毒口支图13HW的生活周期病毒感染和复制HIV主要侵犯人体的CMT淋巴细胞和巨噬细胞，其感染过程包括病毒的吸机侵入、逆转录、基因组的整合、表达及释放等过程。当感染发生时,病毒的外膜糖蛋白即12。首先与细胞表面的84分子结合并与辅助受体CCR5或CXCR4等结合，印120空间构象发生改变，暴露出跨膜蛋白即41与细胞膜作用，导致病毒包膜与细胞膜融合,病毒核心进入细胞内，脱壳后病毒基因组在RT作用下以病毒RNA为模板合成cDNA,再以此CDNA为模板合成双链DNA,经环化后在捕毒IN的作用下随机整合到细胞染色体上成为前病毒而长期存在并随细胞的分裂而传至子代细胞U此前病毒即为病毒复制时的转录模板，病毒进行复制时，早期转录的长链mRNA经拼接后表达病毒的调节蛋白，待调节蛋白的量到达一定阈值后，病毒进入晚期转录，产生的未拼接的mRNA部分用来指导合成病毒的结构蛋白，部分作为病毒的基因组，与结构蛋白进行装配成为病毒核曼鼍！量皇曼曼曼皇曼曼曼!鼍曼皇皇曼曼皇皇皇曼曼皇曼II葛量曼曼曼电曼曼皇曼皇曼曼曼曼曼曼睾量曼詈曼曼曼霞察曼曼曼曼矗皇曼曼曼曼曼曼曼第一带文献综述心颗粒，由胞膜出芽时获得包膜及膜蛋白.HrV感染的机理在HIV感染人体的初期会有病毒血症的出现，并有粒度的发热及淋巴结肿大等症状,随后病毒血症大幅降低至难以检测的水平,抗核心蛋白及包膜蛋白的抗体陆续出现.病程进入无症状带毒期，即潜伏感染期(latentinfection),病毒可潜伏存在长达数年盛至十多年口色其潜伏机制目前尚不清楚&在某些因素的作用下，病毒大量复制，机体再次出现病毒血症并出现艾滋病症状，体内大量的辅助性T细胞被病毒破坏I网,造成机体细胞及体液免疫功能降低，无法抵御外界摘原俄生物的侵袭而发生免疫缺陷综合症.有关HlV的致病机理，目前还不十分清楚，一般认为，HiV感染CD4+T细胞后J病毒通过基因组整合,以前病毒形式存在于CD4+解胞，在感染的早期，通过™细胞分必细胞因子IL^等，在IL2剌激下CD8÷T淋巴细胞对CD4+细胞产生强大的免疫抑制作用,从而使病毒处于被抑制的潜伏状态.在感染的晚期，T⅛2细胞的分泌占优势，通过分泌IL40等细胞因子，使CD8+T细胞失去对CD4+细胞的抑制，病毒增殖并释放出新的病毒颗粒去感染更多CD4+细胞，从而造成CD4+细胞的大量死亡最后耗竭而失去其免疫功能中HIV-I包膜糖蛋白gpl2G的研究进展21包膜糖蛋白前体即侬的合成和加工类似于其他逆转录病毒，HIVj的包膜糖蛋白以多蛋白前体分子的形式在宿主细胞的粗面内质网上合成.编码包膜糖蛋白前体的EV基因位于病毒基因组的后半区，表达产物为一段以Kd的多肽链.这一多肽链在合成过程中进入内质网腔并被糖基化，使分子量达到160Kd,因而被称为期160.即160以单一跨膜肽段锚定在内质网膜上，并在合成后不久形成三聚体.据认为三聚体形式是邰160由内质网转移到高尔基复合体所必需6f,的O在高尔基复合体中，即160三聚体的糖基被修饰成更为复杂的形态，并且每个gpl60分子均被宿主细胞的蛋白水解胡切断,蛋白水解的位置是第511残基附近高度保守的Ly^Arg-X-LysZArg-Arg序列(K为任意残基)，形成分子量分别为12。Kd和41Kd的两个成熟蛋白质，分别称为gpl20和gp41Cgpl20又称为外膜糖蛋白，gp41又称为跨膜3第一章文献踪述糖蛋白），即120包用在即41三聚体表面，以非共价犍相互结合形成即120∕gp41复合体。另外，gp120与gp41之间还可能形成二硫飕，使复合结构更加稳固,成熟的gpl20∕gp41三聚体通过高尔基复合体分泌的大囊泡到达宿主细胞质膜，参与对HIV/病毒颗粒的包裹，包裹毒粒的机制尚不清楚，甚至对于包膜糖蛋白的膜内侧区域是否与病毒颗粒表面的基质蛋白有特异相互作用，仍然存在着截然相反的观点.gp41的胞质侧肽段有长短两种不同类型，它们与基质蛋白的相互作用有显著的差别.外膜糖蛋白gplɔð与受体识别221gpl2O的结构HIV.】入侵的第一步是gpl20与细胞表面的受体分子相结合BL这使得gpl20成为研究得最多的HIV-1蛋白加2。的糖基化程度很高,其分子量有一半以上来自糖链吗全部24个N■糖基化位点都处于糖基化状态，而且可能还有O-糖基化位点。序列对比分析表明，不同HIV-I株中gpl20的变异程度很高口划，这也是HIV-I易于逃避gp120抗体的主要原瓦根据即12。不同区域变异程度的不同，将其序列划分为5个变异区网<V1-V5）和5个保守区（Cl-CS）（如图1,4）.⅞p120图14即120的保守区和高变区由于黜120搪基化程度很高，分子量很大，因而不可能通过X射线衍射和NMR方法测定其结构a但通过大量的生物学、生物化学和免疫学实验，已经积累了很多有关即120结构和功能的信息，LeOnard等根据单抗结合实验和二级结构预测画出了gpl20的结构图（如图222刎20与二04早在1984年就已发现T细胞表面的CD4蛋白是HIV/的特异识别受体忸刈•此后进一步证实，gpl20与CD4的绪合区域主要是C4区r4"LC3区和C5区也参予了与CD4的结合.Smith等还发现可溶性CD4（SCD4）也能与即】2。结合，使印120从病第一章文献综述毒包膜上脱落下来，从而中和HΓV-1的感染.但由于中和反应在大多数HIV-I株系中不能发生，因而，CD4不能作为一种治疗药物.在有些情况下,SCD4的存在反而促进了病毒的感染,实际上，前体蛋白印160合成后的分钟左右就已经形成了可与CD4结合的构象.这时即160与CD4的结合可以抑制CD4的表达，从而降低感染细胞表面的CD4受体浓度•减少胞外HiV-I病毒对感染细胞的过度感染，并有细胞毒作用拗L图L5gpl2O的二级结构图即2.2.3gp120的共受体仅有CD4并不能充分解释HIV-I细胞嗜性.很早就发现，HIV-I不能入侵整合了入CD4的小鼠细胞。但将人的CK细胞与小鼠CD4+细胞融合以后，HIV」则能进入杂交细胞,另外，特定的HIV/株只能感染某几类人CD4+细胞，但不能感染其他类型的人CD4+细胞.这些实验都说明HIV-I的入侵还需要人类细胞表面的其他具有组织特异性的辅助因子.MI。年的努力，直到由年终于由旅美学者冯愈及其同事鉴定出第一种嗜T细胞HIVj感染所必需的辅助因子一融合素(fiɪsin),融合素的基因定位于人2号染色体，由基因序列推测融合素长352残基，是具有2个N糖基化位点,7个跨膜片段的G蛋白偶联受体，与人CXC类趋化因子受体有较高的同源性印】.此后不久，邓洪魁等又发现了初始嗜巨嗜细胞HIV-I株的共受体(co-reBptor)-CC类趋7第中文献身迷化因子受体∙5(CCR∙5)脚加。5am*on等克隆了CCR-5的基因.推算出该蛋白质为325残基，7螺旋跨膜，共受体与即12。的相互作用非常复杂•一般认为，即12。在与CD4结合以后，经过构象变化而形成了共受体的结合位点,AtddMl等的分析袤明，HIV」入侵需要即120与共受体形成一种复杂的结构，而决不仅仅是简单的位点结合.这种结构一旦形成，就使印120与印41脱离，从而启动了HlV-I入侵宿主细胞的下一过程：膜融合网.跨膜糖蛋白gp41与病毒一细胞融合HIV-I不仅能使其包膜宿主细胞膜融合，而且能介导被感染细胞与周围的CD"细胞发生融合,形成合胞体,这种现琼可在细胞培养和艾滋病病程中观察到.直接参与病毒一细胞融合或台胞体形成的是部41的膜外侧区域〔对.该区域从N端起依次为触膜肽(IUskmaptidD,螺旋段1(Hl)♦免疫环区(IM)＞螺旋段2(H2).23.1融膜肽最早确认直接参与融合的是即41蛋白N末端的一段高度琉水的序列器膜肽RL很多包膜病毒中都存在着融膜序列，其中研究得最多的是甲型流感病毒(MluegA)HQ蛋白的融膜肽「般认为流感病毒融膜肽的构象为两恻极性不同的螺旋.但这种模型并不能普遍适用于其他病毒的融膜肽，NieVa等通过Fourie变换红外光谱分折发现，HIV-I融膜肽中有β结构。KJiger等的CD谱测定也表明HIV-I融膜肽中只有3Q%左右的螺旋.我们通过二级结构预测和分子力场优化方法获得的融膜肽构象为螺旋、片层和转折约各占三分之一的“插销，彝构，这种结构使融膜肽易于进入脂质膜但难于被拔出，并能较好地解群有关HlVrl融膜肽的一系列实验结果.232封膜外侧区的螺旋六员束结构1997年，在Cell和NaIUie杂志上分别发表了gp4l膜外恻主要区域(Hl和H2)晶体结构的X射线测定结果，在晶体结构中，三段Hl螺旋平行排列于中央形成核心一三段H2螺旋反平行地围绕在周围，形成蝶旋六元束网(如图L6).这证实欧⑷以三聚体存在3』窄叫澄清了HIV∙1包膜糖蛋白是以三聚体还是四聚体存在的疑问.更为重要的是，Wei器CTIhOE等指出了该结构与流感病毒HA2蛋白和MoMuLV跨膜区的共同点，.IQ.第一章文献踪述提出三种融膜蛋白在行使功能时可能有类似的机制.图L6gp41膜外区的OI螺旋核心结构域（A）轴向（B）侧面HIV-I入侵机制基于gpl20和即41结构研究的新信息和我们对融膜脓构象的研究结果I可以描绘出HIV-I入侵宿主细胞机制的如下模型［在感染前状态时,gp41三聚体的核心螺旋（Hl）三员束被外围螺旋（H2）三员束和三个gpl20所包乘与CD4的结合后'即120离开印41三聚体，并将印41的Hl螺旋从中央拉出国L印12。进一步与趋化因子受体的结合使之与gp41完全脱离，随即Hl伸展出来，使N末端的融膜肽到达宿主细胞表面并牢固地插入细胞膜中,此后gp4t三聚体进行了Hl与H2相互靠拢的构象变化，重新形成平行的螺旋六员束,这一变化提供了病毒包膜与宿主细胞膜的水化表面之间相互靠近所需要的能量，将两层膜拉近，多个即41三聚体在两层膜接近处形成膜间的融合孔.膜的流动性使融合孔很快扩大,最终实现HIV-］包膜与宿主细胞膜的融合,使HIV-I核心进入宿主细胞质中叫HlV诊断与检测的现状自从发现了人类免疫缺陷病毒以来，人们就-宜在致力于检测HIV,作为实验室诊断HlV感染的一个重要依据,早期的诊断，主要是通过血清学实验检测抗HlV抗体,间接诊断HlV感染,迄今为止，血清学实验依挑是HlV实验室诊断的主要依据中L目前，艾滋病实验室诊断技术还包括HIVP24抗原测定，病毒分离.HTV病毒载量测定,HIV核酸检测和CD4细胞计数等0这些方法或作为抗体检测方法的补充用作辅助诊断，一.——一―― ―第一暗文型综述—或作为判断预后和指导治疗用药的依据，主要用于T特殊情猊(窗口期叫矍儿诊断、HIV抗体检测结果不确定等)，一般不用作常规诊断，HlV病毒载量测定和CN细胞计数是判断预后的两项重要指标•近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，HIV的实验室检测也正发生着日新月异的变化.从聚合酶链反应(PCR)技术应用于HlV的检测,到荧光定时定量PCR的应用，再到基因芯片的应用,每一步变化，都给人们带来惊喜,都使人们对未来检测HIV的前景,以及最终控制艾滋痛充满信足31血清学实验血清学试验即HIV抗体检测，是HlV感染诊断的常规方法，检测步骤包括初筛实骁和确认实验.最常用的初筛实验和确认实验分别是酶链免疫吸附实验(EUSA)和免疫印迹实验(WE)网LXLlEUSA实验F初筛用的ELISA试剂在经过了第一代、第二代，第三代后，已经发展到了第四代检测试剂㈤1985年，美国批准使用第一代ELISA检测试剂，第一代试剂主要以病毒裂解物或部分纯化的病毒抗原包被反应板，以检测血清中的抗体Q由于包被的抗原不很纯，假阳性率较高.结果不令人满意•1990年，第二代试剂应运而生，核试剂使用基因工程方法得到的重组抗原和合成肽包被反应板，由于纯化抗原的使用，特异性有了但大提高a第三代试剂，使用双抗原夹心法检测抗体，进一步提高了敏感性困小L第四代试剂，则在第三代的基础上进一步增加了P24抗原的检测，把HiV抗原和抗P24的抗体同时包被反应板,同时检测血清中的HIV抗体和P24抗原，进一步缩短“窗口期%与第三代试剂相比,第四代试剂检测窗口期大约平均缩短了45天.第四代试剂已于1998年在欧洲注册使用.第四代试剂在缩短窗口期的同IFf,我们也应该注意到，由于同时把抗原和抗体包被在反应板上，存在互相干扰的可能，检测的敏感性和特异性可能都会受到影响.一般来讲，第四代试剂检测P24抗原的敏感度QdlOOpgZmL),不如单独检测P”抗原的敏感度高¢15-10pg/mLL在Meier发现的一个HiV急性感染的病例中,用第四代检测试剂(Vidashivduo).病人有临床症状的第2-9天样品的检测结果全部阳性，有趣的是，使用上述试剂第10、I1天的检测结果为阴性,直到第13天的结果才又转阳,文第一点文献琮述章中把转阴的时期，称为“第二窗口期”「笫二窗口期”存在的原因是由于急性HiV解染病人病程中，存在从血清P24抗原降低到抗体升高的时期*当此期的抗原抗体低于试剂的检测限时，试剂检测靖果为阴性，而当Weber闸应用VIDASHIVDUOUta和Mur^HlVA&AbCombi由ion试剂检测上述病人血清时，没有发现“第二窗口期，VIDASHIVDUOUltra和MurexHlVAWA⅛combination试剂的P24杭原检测限分别是3pg/mL和5pg∕τ∏产.因此，从文献报道看使用敏感的检测试孤可以避免“第二窗口期.’的出现.这一点也提醒我们，在选择国外的第四代试剂时应如何选择.我国国内的生产厂家在研制第四代试剂时也应注意提高灵敏度，避免“第二窗口期”的出现.3.L2快速检测（RT）实验；随着对感染者和艾滋病患考抗逆转录病毒治疗的进展，以及对无症状HIV赚染者提供自愿咨询检测的迫切需求，HlV检测试剂，一方面朝着提高敏感性,特异性，缩短窗口期的方向发展：另一方面，朝着简便快速方向发展叫目前已有明胶颗粒凝集试验（PA）、Dcterminu,斑点印迹（⅛>tunmimoassay）等简便快速方法，明胶颗粒凝集试验（PA）：PA是HIV血清抗冰检测的一种快速方法,该方法是将HIV抗原致敏明胶颗粒作为载体，与待检标本作用，混匀后保温（一般为室温）,当待检标本含有HlV抗体时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原.抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝聚情况判读结果口31.22斑点ElACdot-EIA）5原理同EIA,但以硝酸纤维素膜为载体.将HIV抗原滴在膜上成点状，即成固相抗原H加血清标本作用，以后步骤同ElA.阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点，反应时间<10InE抗原使用少.3.L2.3斑点免疫胶体金（或腔体硒）快速试验；与斑点EIA相似，也是以硝酸纤维素膜为载体.区别在于不用酶标记抗体,而代之以红色的胶体金（或胶体硒）A蛋白，用渗滤法作为洗涤方法.试剂稳定，可以室温长期保存.实验时不需任何设备，快速，简便，特异性好，敏感性约相当于中度敏感的_ 二____ 第_幸g秋媒述 EIA1适用于应急检测和门诊，急诊个体诊断.目前在国内批准注册的国外进口试剂有DetennineHIVU2（ABB0TT,雅培）和InSuntCHEK-HIV1+2（EK）两种金标（硒标）快速诊断试剂，一般10-3Omin内出结果口艾滋病唾液检测卡（萨丽卡，SalivacardJi在萨丽卡的硝酸纤维膜基质上包被人工合成的HlVgP41∕gp36蛋白抗原，可同时检测含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗体,原理采用酶免疫间接法,主要检测唾液中的HIV⅛A与⅛G抗体.敏感性和特异性与EiA相近，避免静脉穿刺鼻但标本预处理时间长且售价昂贵，以唾液为标本测定HrV抗体的EIA、WB试剂已获得美国FDA批准代小国内尚无错售今3.L3尿液HlV抗体检测工1996年美国FDA首次批准HIV-I尿检EIA试剂，我国也正在研制,主要适用于静脉注射毒品（IDUG人群和其他高危人群的大面积流行病学调查・阳性标本仍须采血作确认试验才能确定HlV抗体阳性・3ΛA确认试验确认试验即应用免疫印迹试验（WB）,是将HIV病毒蛋白用十二烷基磺酸钠.聚丙烯酰胺凝胶电薄（SDS）,把分子量大小不等的蛋白带分离开来.然后再把这些分离的不同蛋白带电转移到用酸纤维素膜上,将此膜切割成条状，每一条硝酸纤维膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原，将特检血清样品用稀释液稀释成［:⑻再把它直接加到硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应，血清中若含有抗-HIV抗体，就会与膜条上的带相结合.加入抗人IgG酶结合物和底物后，即可使有反应的抗原.抗体结合带呈现紫褐色，根据出现条带情况判定结果•我国判定标准：（1〉HIV抗体阳性：至少2有条膜带（即gpl6Q⅛pl20∕gp4l）和至少有1条膜带和p24（核心）带同时出现“（2）HIV抗体阴性，无HlV抗体特异性带出现.（3）HIV抗体可疑工出现HIV特异性抗体带，但带型不足以确认阳性者，世界各国（或机构）对免疫印迹试验的结果判定标准并不完全一致•美国传染病中心的判定标准是：HIV-I阳性［任两有其中2个条带（p24,gp4l.gp120/160）J,HiV々无阳性：而WHo的判定标睢是：HlV“阳性（不管有无核心带或酶带，但有2条膜带），HIV-2阳性（不管有无核心带或醒带，但有2第一书文献徐述---■---条膜带即为阳性）附型LɪzHlVP24抗原检测通常采用夹心法ELlSA,即将纯化的已知抗体包被在固相反应板孔底，当加入待测血清后，若血清中含有p24抗原则与包被抗体形成抗原.抗体复合物，再加入前（HRP）标记的HlV抗体，在抗原上又结合了酶乐记的抗体，加底物显色后，在酶标仪上读结果,近年来为了提高检测血清中p24抗隙的敏感性，将血清中免疫复合物解离（IOT>后再进行测定•发展了ICDP24抗原测定试剂，用于HIVp24抗原测定［'苒3.3核酸检测应用聚合能链反应（PCR）技术检测外周血淋巴细胞中HJV的前病毒DNA序列，或用逆转录∙PCR（RT-PCR）法检测血浆中游离HrV的RNAH叫主要用于以下情况工¢1）早期诊断国产期感染；（2）对HIV抗体免疫印迹试验的进一步做出诊断；（3）在HW抗体未产生之前L窗口期'9辅助诊断急性原发感染I为阻断“窗口期FIV经血传播，有些发达国家已将HIVRNA的RT-PCR检测纳入血源检测:（4>区别HIV-I和HIV-2感染,（5）确定人群中HIV的变异*（6）监测临床药物治疗反应：（7）检测病毒的耐药性突变口3.4基因芯片技术的应用基因芯片技术是近年来发展起来的新兴的生物技术，是指将许多特定的寡核甘酸片断作为探针，有规律的排列于固相支持物上，然后与待测的标记样品的基因进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息叫基因芯片技术以其高通量、快速检测的特点，在基因表达、肿瘤诊断，遗传病诊断.基因分型等诸多领域得以广泛应用*在HlV检测方面，Anymetr⅛公司开发出GeneChiPHiVPRT440芯片.用于抗HlV逆转录醉和蛋白函药物的耐药性分析，对B亚型的检测结果很好，但对非B亚型的耐药性检测存在漏检和错检.33CEM/CD8细胞计数HIV感染人体后的主要靶细胞是C04淋巴细胞（也累及其它细胞）.随着病情的第一书文献惊述演变，HiV复制加快，尤其在AIDS临床阶段，其在淋巴结中每天复制可达IOO亿左右，)9且大量释放到血液循环札使更多的免疫细胞与其它细胞被感染，引起每天破坏的细胞 J数以百万统计.大量细胞的破坏，使CD4淋巴细胞数急剧下降使免疫系统严重被破 鹿坏［叫一般认为在疾病早期84淋巴细胞KλAltf⅛,中期为(0.24.5)MIoqzL,晚期则为(0.054)2)乂1渣兀，而临终期可‹OQ5Mθ9∕U尽管CD4淋巴细胞数不一定能和病毒载量相吻合，但确实是估计病情，预后,以及开始治疗的指征之一.在测定ClM淋巴细胞时，一殷同时测定88淋巴细胞叫一方面可以了解CDg淋巴细胞的变化情况，另一方面两者的比值也是很重要的疾病严重程度的指标⑶闺.CD4∕CD8比例通常为2:1,但变化很大,自1:1-3:1不等“若比值＜4则意味着免疫状况不佳.比值越低,则细胞免 Lh疫缺陷越重.&论文研究的目的和意义■我国目前HiV流行日趋严重，在没有廉优、有效的药物和夜苗的情况下,必须加强监控，防止病毒传播B因此，准确.快速、低成本的HlV检测系统无疑是当务之急.HIV-I主要抗原蛋白gp!20是目前双抗原夹心法拴⅛SHJV抗体的试剂盒所必需的抗原，为了探索利用基因工程方法大量生产gpl20的可能性.本试验开展了HIvnfipl20s蛋白的体外表达研究.采用大肠杆菌系虢表达即】幽的片断基因，并进行了抗原的纯化，免疫原性的鉴定以及初冬应用于HtV抗体检测，以期为开发新一代HlV检测试剂盒提供诒断抗原.λ第二京HIV√gpl20s在大幽杆簿中的表达.整定、鲍世利初步应用...⅝⅝=gJ=MLJ-J.一第二章HnMqPI20s在大肠杆菌中的表达、鉴定.纯化和初步应用DNA重组技术自从问世以来发展迅速，其突出的进展就是将外源基因在原核生物（如大肠杆菌）或其核生物（如酵母）中进行表达，使人类获得了以前无法大量生产的功能蛋白•既2。曾经在8≡27等ReV缺陷系统、哺乳动物细胞、酵母菌“工大肠杆菌、昆虫细胞、及各种病毒载体等中进行过表达.但是在其核表达系统中通常难以表达或者表达的蛋白活性极小，而在大肠杆菌等原核表达系统中却有许多其它系统无法比拟的优点，大胸杼菌表达系统由于遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统，Emli遗传图谱明确,容易培养且费用低,对许多蛋白质有很强的耐受能力，能高水平的表达这些蛋白质.本实验选用了大肠杆菌原核表达系统“ ^呆L材料Ll菌种和质粒RcoliBL21CDE3W,基因型为FQmPTbS端碗面加曲0期3“海（CnIR），为本室保存.2）质粒PHXB2-鸵160包含HlV-I国际标淮株的即160全序列，为本室保存.3）原核表达载体pET32a含有T7噬菌体基因启动子，为本室保存。材料和试剂CMyC单克隆抗体购自Invitrogen公司；HRP标记的羊抗鼠IgG、HRP标记的兔抗羊IgG购自北京鼎国1羊抗HW抗体购自BiMeSigIUTa4DNA聚合酶、T4DNA连接霹、EcoRl和XhoI均购于宝生物工程有限公司：细胞溶解的购自Sigma：甲醇购自TEDIA（色谱纯XAmP购自Invitrogen;质粒提取及胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司［DNAMarkerDL2p000和DLl5,。00购自大连宝生物;ECL显色试剂购自Pierce：DAB显色试剂购自华美有限公司；DNA测序为北京奥科提供，皇第二百HIVifipl2口0在X既杆菌中的麦达、签定•葩化和初岁应用实验器材EPPsdorf核酸蛋白检测仪，基因公司酶标仪，宁波新芝公司超声波裂解仪∙NI-NTA柱由本实验室提供Il甘华利f⅝W⅛⅛ι⅛7ki石 ‰-™T7*r∙ir⅛。惘kmIm TOTrX*T*edf叫Wt SttBSffS*TaflEdIflR⅛βqμeπcr 2谆溺WiliijhMvslEEwH•如门 I势工。Hg∙T⅝gcodlπ⅞sηwικe IMMsTT78IEM8 眸口hM3⅛sm∣∣mκw 1∣7∣-Z2⅞α烟OnMIIM 蝌jtfiiccd∣n∣MTUwκB 4¼‰530S∏g∏Ijn 3皿TtefτsφξκfgrpET-3Zb^*JlΛπti.pt7F-3ZcE*l∣

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一■■一一一一一一-一一一一一2)细胞裂解缓冲液II:5OmMTriACl(PH8.0),JmMEDTA(pHS.0),IOOmMNaCl.3》包涵体溶解缓冲液I;5QmMn⅛Cl(pH8.O)rImMEDTA(PHSO),IOOtnMNaCL

8M尿素，0.1MPMSF，后两个成分现用现配,4)包涵体溶解缓冲液11：5001家式11毋。山汨10,7),】014£014相118.0),5QmMNaCle5)Ni-NTA纯化精液：10OmMNaH2PO4∙2H2O,IOmMTris∙C1,30OmM的imidazole.6)NativeNi-NTAbuffer;①LySiSbIIfl⅛rCPH8,0λ50πιMNaH3FO4*H3O,30OmM

NaebIGmMimidgla②WaShb同(PH8∙0):50mMNaH2PO4-H3O,秋mM

NaCI,20mMimidazole；©Elutionbufler(PH8r0):50InMNaH3PO4・用0,30OmM

NaCJfZOmMimidazakqZ方法ZIPCR反应扩增目的基因即120是一种糖蛋白.由HIV-I的CnV基因编码,研究表明，表达gpl20的全长时基本

没有表达或者表达量极低，因此本实验选取了mv上能诱导产生特异性抗体反应的主要

抗原决定簇V3,C3N4,α,V5的部分基因序列,采用PrimC60设计合成了两对PCR引物.分别

在上游和下游引物中引入EsRl和Xhgl酶切位点.引物由北京奥科公司提供合成.扩增即12。外膜糖蛋白537bp基因命名为：即120通次120S上游引物

5-GCGGAATrCCTGAACACAΓCTGTAGAAATTAAΓΓG-3*含EcORI酬切位点，gp!20s

下游弓［物5-ATACTCGAGCTCGGACTCATTGTTGCTATTACC-3,含Xhul酶切位点*DNA

片段长度为537bp.PCR反应体系50gL(质粒物μ即25mmoVLMgCl25μL,IOxTaqExbuffer5μLr2.5

mmol/LdNTPlPL,20mmol∕L1上下游引物各IllL.,无菌去离子水34,5χL,SfTaqEx

0.5灰)，扩增条件(94Q热启动3mim94'C变性3弧58C退火3风72七延伸4钻，34

个循环后工72t延伸】Omim4C储存备用.PCR扩增产物取5pL在Lθ%琼脂箱上电泳检

查，剩余的用小量PCR产物试剂盒炖化.½「弓po第二章Hwl即已勺至大肠杆菌中的囊送.翌定，纯化和相步而用一— 脂22重组大肠杆菌工程菌的构建221重组质粒的构建同时用MRI和Xhol双醒切印3的PCR产物和表达载体PETm琼脂糖凝胶电泳分离片断，用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的片断.然后在T4DNA连接薛的作用下，将基因片断与载体按摩尔比3一相连接，连接产物转化感受态大肠杆菌宿主细胞DH5以大肠杆菌感受态细胞的制备和转化方法参考文献回L质粒提取按照华舜质粒提取试剂盒说明书进行.对提取的重组质粒分即进行PCR和酿切鉴定.将鉴定为阳性的克隆菌液送交北京奥科公司进行DNA测序分析.重组质粒PET32跺-印12加的构建示意图见图22；图22重组质粒pET32a-期12饱的拘建示意图Fig2.2:Cα∏9tmc⅞]αnOfrecombinantPIaSmidPET32a-即120s222大肠杆菌BL21感受态细胞的制备接种BL21菌株于3mLLB培养基摇过夜.次H按t/100的比例接入LB培养基∙2-3h 第—电尸巩印3在大肠叶碎的衣达、婢、钟生和胡则用 至对数期，OD600为。4。6移至50mL离心管，冰浴1。∙"。4≡pm离心由凡去上清心倒置lm⅛(f用JOmLO.IM的Cad2重悬，冰浴IOmimJ4。4000ψm离心IoinH去上清，倒置Imim最后用ImLalM的Cad2重悬，加入】mL30%的甘油,分装保存在∙70'C冰箱，备用.223重组表达载体的转化用BL21感受态细胞转化［取5(⅛L制备的BL21感受态细胞，加入85NL线性化的重组质粒，混匀后冰浴30τ∏im42匕水浴热休克兜S,冰浴1-2Eil1,加入InILLB培养基，37"Ct200rpmr温育45min复苏，4C,3500τpm,离心5min∙将菌液浓缩至150∙200RL涂布在含100μg∕mL的氮苇青霉素的LB平板上进行筛选，？7匕倒置培养14∙16h.直至有克隆长出.224转化子的PCR鉴定挑取由pET3禽.即120s质粒转化的ESCheriCh⅛COli菌落少许，PCR反应体系50HL<25mmoVLMgCl2SgL1WxTaqExbufi⅛5μL>25mmol∕LdNTPlμLf15mmoVL的片段上源引物S-GCGGAATTCeTOAACACATCTGTAGAAATrAATTG-3和15mmoVL片段下游弓I物(5,-ATACTCGAGCTCGGACTCATTGTrGCTATTACC-3r)各1陷，无菌去离子水36∣ιL,在PCR仪中95匕热启动5min,添加lμl的TaqEX酶(3U∕μL)进行扩增,扩增条件(95C变性Imim54P退火Imim72P延伸ImiIU30个循环后，72公延伸7min)(f取10μL的PCR产物进行1%的凝胶电泳.2.3目的蛋白的表达和鉴定 B231小量诱导表达划统法分离工程菌,挑取单个菌落活化培养，按1%在含有IooUgZmL氨莘青霉素的LR培养基中转接培养.37。，250ψm振荡培养与4h时，OD600为0,5-LOB加入IoomMIPTG,使终浓度为ImM,继续培养3∙5h0再将培养液室温9∞0g离心5m⅛,上清和沉淀于∙70lC保存口 ：工程菌的诱导表达向待分析的样品中等体积加入2XSDS凝胶加样缓冲液,混匀后置于沸水浴中5min„第二章hπmspi⅛⅛在大居肝苗中的表达、赛定、细化和初步应用制备分离胺浓度为12%,浓缩股浓度为3.5%,每板胶恒流20InA电泳.电泳结束后用考马斯亮赛R-250染色液染色46h,回收染色液，用脱色液进行脱色，即可分析重组蛋白的表达情况.表达蛋白的可溶性分析将ImL菌体沉淀重悬于IOOPL细胞裂解缓冲液L冰浴IOlnim反复冻融3次（液氮1C⅛,371水浴3min）∙4七120。Og离心5mi∏,上清为可溶性蛋白，沉淀为包涵体成分.作SDS分析.235最佳诱导时间的筛选选取诱导的最佳时间.在1,2r3,%5h时，分别取适量相同体积的菌液，离心去上清，保存.等体积加入2XSDS凝胶加样缓冲液，混匀后置于沸水浴中5mim制备分离胶浓度为.浓缩胶浓度为3.5%,每板胶恒流2。强电温电泳结束后用考马斯亮蓝区250染色液染色4∕h,回收染色液,用脱色液进行脱色，即可分析最佳的诱导时皿Westemblot分析电转印；准备与要转印的电泳胶大小相同的六层滤饿和一张PVDF膜，将膜在甲醇中浸泡N水中浸泡2皿熬后同凝胶一起放在转印缓冲液中平衡15min,从电转移仪的负极到正极依次置放三层滤综胶，PVDF膜，三层滤纸，注意不要使各层之间有气泡，连好电源，4C恒压IOoV电转印ILI冲洗:转印后的PvDF膜用PRST冲洗3次,每次5min封闭工膜用PBST溶液配制的5%脱脂奶粉室温封闭IhI结合一抗：用含1%ESA的PBST按I14000稀释一抗,将PVDF膜放入anti-myc中室温结合2h 第二-i±⅛ι±任J照）芭吵也⅛-总也缈匕称核.曲用回收一抗，司0C保存，用PBST洗膜5次，各5mint结合二抗ι将膜放入稀释好的HRP标记的山羊抗小鼠IgG溺液中，室温Ihi用PBST洗膜6次，各DAB显色2A重组蛋白的纯化241包涵体的提取与纯化侬】1）制备细胞抽提物称重菌体沉淀，每克（湿重）菌体加入3mL细胞裂解缓冲液IL玻璃棒搅动重悬菌体，每克菌体加入如LloomMPMSR典PLwta助nL溶菌酶，推动2Qmh每克菌体加入4ιι隼脱氧胆酸.置于泳浴上进行超声波裂解，参数为：IOOW超声10s*间隔20s,超声30次.Z）纯化和洗潦包涵体 ....•细胞裂解物4X∏2tXX⅛离心15min,去上清,每克菌体重悬于ImL水中“每支IOOlIL装4支离心管，其余4P保存M4七12000g离心15m⅛u每份沉淀重悬于100μL含不同浓度（0.5,K2,SM）尿素的αiMTιisC（pHg.5卜4X∏200<⅛离心15min.取上清，沉淀重悬于100μL水中.各取10μL上清和沉淀作SDS分析哪个浓度的尿素洗涤效果最佳，井用最佳浓度洗涤剩余包涵体沉淀.3）溶解包强体每克沉淀重悬于IooUL包涵体溶解缓冲液J室温静置Ihi加入9倍体积的包涵体溶解缓冲液IL室温放置30min,维持PHlo7用】2M盐酸将PH调至&0,室温放置至少30mim室温12W）Qg离心〔5面3上清即为溶解的包涵体,4）透析复性将包涵体溶液装入截流分子量为60曲8000道尔顿的透析袋，置于4力在IOOOmL第二章叫的刎那在大麻杆菌中的极二挈定、钝哟初对应用PH6.7的PBS溶液中进行透析复性，Ih更换一次透析液，共3次.对透析前后的蛋白分别进行BradfoE蛋白定量，以计算复性效率.复性蛋白溶液分装后保存于-70匕.B除Ifbrd法测定蛋白含量方法为，在96孔板上以BSA为标准蛋白•设5∙6个稀释度，蛋白浓度从0J-L4mg∕mL,每个样品设平行三复孔T每孔加入样品液*L,再加入Bradfordreagent2（X⅛L混匀，室温放置Iornim595m波长比色，记录结果.用BSA的测定结果作标准曲线，求得待测样品的蛋白浓度.242银拄亲和纯化目的蛋白附」2.421自制银柱Ni-NTA载量：0.3μMProteinZmL介质”本实验获得的印12。S蛋白的分子量约为40Kd,则应加的介域量为12mg⅛ιL介质.依此比例加入介质和蛋白质样品,用超纯水洗柱子三次，堵住柱子出口，取适髭介质（含5%树脂）混匀,装柱，待自然沉淀分层,重力作用下流尽液体，加入用于平衡的Lysisbuffer平衡柱子两遍。加入LySiSbUff⅛r少许,置4t备用电2.422制样用透析显性的后的蛋白gpl20s-242.3亲和层析纯化将准备好的样品即120s加入柱子中，4匕缓慢摇动平衡约Ih,待裂解上清液与镶柱充分结合后，重力作用下流尽液体，收集流尽液体，再过一遍柱，取20lxL样品留待分析，重复该步一次，取OJmL洗脱缓冲液加入银柱J收集重力作用下流尽的液体，重复洗脱六次，分别取20μL样品留待SDS分析，其余样品∙70C冻存备用.2.5纯化蛋白的初步应用将纯化的即120用被液稀释成20圈∕mL,包被褥标板，IOoμl√孔，用间接EHSa法检测4份已知的mV阳性血清“用纯化的印12。蛋白按每孔20Ong包被反应板，进行间接ELiSA法检测HIV试剂盒的阳性对照和阴性对照，具体方法如下*苒FHw则加本大腼杆菌中的表应寒定、纯化前初步成用将抗原用碳酸款缓冲液稀稀，每孔50HL于4C过夜包被ELISA反应板吸出抗原液体，用PRST冲洗反应板3次，每次拍干1用5%脱脂奶粉的PR&T37C封闭2h]吸出封闭液，用PRST冲洗反应板3次，每次拍干I50M√孔加入稀释好的一抗，37C结合IhI吸出一抗,PBST冲洗反应板5次，每次拍干I50jιL√n加入稀释好的二抗，37C结合4⅛ninJ吸出二抗,PBST冲洗反应板5次，每次拍干]每孔分别加入显色液A,B各50.L,室温显色Iomhb加入2MHaSO.50∣d√孔，终止反应在醉标仪上用双波长A450.A«o检测光吸收值3.结果3,lgpl20s的PeR扩携结果取5μLPCR产物在1%琼脂糖凝胶上以DL2Q00为标准分子量对照进行电泳，结果扩增出大小约537bp的片段，与预期的gpl203片段大小一致（下页图2.3）,3N重组表达载体的构建及鉴定用ECDRI和XhOl分别对PCR产物与载体pET32a双随切，用T4连接酶连接，构建第二章HIYrgPl2⅞在尢断杆菌中的表达、鉴定.塾色和初步应用^_的重组载体经双酶切鉴定并送往北京奥科DNA测序分析，结果表明gpl20s片段基因成功插入分泌型载体pET32a且方向正确，重组载体pET32a-gpl20s构建成功上在氨节青霉素抗性平板上，挑取按方法2.2构建的工程菌8个阳性克隆转化子进行菌落PCR鉴定，其中6个扩增出537bp的目的片段（见下页图2八随后再进行小量提取质粒作EmRI和Xhol双酶切鉴定,重组质粒酶切产物分别在5900bp（载体）和537bp（插入片段）处出现条带（见下页图2.5）,初步鉴定表明HrVgPI2。&抗原基因片段已克隆人载体pET32a中。将鉴定为阳性的克隆菌液送交北京奥克公司进行DNA测序分析'所测序列与目的序列相同，读码框正确，说明鸵120,基因正确克隆到载体pET32a中0130IM图23gp120s基因PCit产物的琼脂糖电泳鉴定1：蛋白分子量：2：即12拆PCR产物，Fig2^IdentificationOfPCRproductofgpl20β.∏e

l：DL2000maι⅛2:PCRproductofgpl20s33工程菌的诱导表达重组质粒pET32a-gp120s转化的菌株BL21（DE3）经IPTG诱导培养4-5h后，收集菌体进行经SDS电冰检测，绪果在预期的位置出现了大小约如Kd的诱导带（图2,6）,为磔120s蛋白与TGA的融合蛋白，表明gpl20s蛋白获得了表达，经凝胶呈像扫描分析，表达蛋白量约占菌体总蛋白的4535%.第二章HIV-IgpIZte在大肠杆菌中的表达、鉴定,纯化和朝步应用123 4567 891011图2.4：重组子菌落PCR鉴定hΦX174HaeIIIMarkerj2〜如1~8号转化于；10：阴性对照；IL阳性对照。Fig2.4PCRanalysisoftransɪbmiants1Λ>X174HaeIIImarker;2~9:l〜8#clone;lθ:negativecontrol;ILposmvecontrol.75005000500一250-图2S重组质粒PET32appl2儡酶切鉴定1：蛋白分子量标准,2：蛋白分子量标灌；曳pET32a-gp!20sEcoRVXhohFig2JRestrictionmapTeCQmbinaIHplasmidItDLl5000marker;2:DLiOoOmarker^:pET32a-gp1205EcoRI/XhoL表达蛋白的可溶性分析结果（下页图2.7）表明，表达产物主要以包涵体形式存在于沉淀中，而裂解上清中几乎没有目的蛋白表达,第二章HBMgpl初5在大肠杆菌中的表达、的定，纳优和初步应用最适诱导时间筛选结果诱导后进行全菌体电泳分折（下页图2∙8）,结果表明在诱导4h有较高的表达量,随时间的递增表达量并没有明显的递增,因此确定最佳诱导培养时间为4h41 2 3 4 5 6 7图2,6：BL2l(DE3卜pET32≡加外表达的SDS分析1:蛋白质分子量标准2空载体未诱导：3：空载体诱导工4,6：工程菌未透导t5*7：工程菌经德导•FigZ6SDS-FAGE皿腔。华@叫PEmWhproteinmarker;2:vectorcontrolnon-iπducc{⅜3.vectorcontrolinduced;pET333-gpl20snon-inductd57:pET32a-gpl2ftsiπduce<l.pET32a-即120s表达产物的Westcm-Blot分析耨小量表达收集的菌体沉淀，做SDs,然后电转化至PVDF膜上"用羊抗HlV单克隆抗体作为一抗，HRP标记的兔抗羊IgG作为二抗，或用GM药单克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗*DAB显色，发现在40Kd处有特异条带，无非特异性条带出现,而未经诱导的菌体蛋白对照中没有条带显示0说明鸵120短片段基因（约40Kd）被大肠杆菌所表达.WeStem∙Bk>t实验表明（下页图工9），表达产物具有良好的抗原性及特异性，第二章HlVj即12空举肠杆蓄中的表达、颦星」缱娅加箜再包涵体的变性，复性粗纯化的包涵体经过8M尿素溶解,透析复性后，得到较纯的gpl20融合蛋白，但是有杂带未去除，复性后蛋白浓度

复性前蛋白浓度xlOO%=CLO85mg⅛LXl(w%=13.0%

0.654mg/mL与文献网报道的复性效率相近.18表达产物蛋白的纯化诱导后收集的菌体经过WM尿素裂解，透析复性后*得到的gpl20s仍有杂蛋白，进一步上银柱去除杂蛋白。在非变性条件下进行Ni∙NΓA纯化带有6KHist昭标签的融合即12保蛋白,结果用pH&O的洗脱液进行洗脱得到较纯的gpl20s蛋白（下页图2.10），经可见光扫描分析纯度达到85%。图2,7：BL21(DE3>pET32a*gp]20s溶解形式分析k蛋白分子最；2：包涵体；3：裂解上清.Fig工7;SDSanalysisoftheinclusionbody1；Proteinmarker;出IiKluSiQnbodyOfBL21(DE3)-pET32a-gp120s;BL21(DE3)-pET32a-βpl20slys⅛SupcraatanL第二章HnM即用人在大肠杆菌中的表达*罂定、纯化和初步应用图2.8：将导时间对BL21(DE3>pET32a^pl20s表达量的影响

h蛋白分子量标准；2-6：诱导时间分别为IW小时，Fig2.8:gρl20sexpressedatdifferenttime≠LDL20∞M即26WEtiV的3.9初步应用分析用纯化的gpl20s蛋白包被反应板，用间接EIi跄法检测,对4份已知的HrV阳性血清进行间接ELISA检测，结果(下页表1)表明纯化的gpl2(⅛蛋白可以特异性的与HIV阳性血清中的抗体进行结合，具有一定的反应原性•图2,9；BL21(DE3)∙