答辩铁皮石斛多糖

组培铁皮石斛多糖的提取及其抗氧化性研究(1)姓名：董燕平学号：20090453012专业：食品科学与工程学校：西南林业大学1目录组培铁皮石斛多糖简介及国内外研究现状试验目的和意义试验方法和内容试验结果试验结论结果讨论致

谢21.组培铁皮石斛多糖简介及国内外研究现状

1.1组培铁皮石斛多糖简介

铁皮石斛（D.candidumWall.exLindl.）是兰科石斛属多年生附生草本植物，生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，种子极小、无胚乳，在自然条件下，需与某些真菌共生才能萌发,故很难生产足够的实生苗用于栽培;而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低，加上人为的过度采挖和破坏生境，其资源已濒临灭绝，是被国家列为重点保护的药用植物之一。铁皮石斛多糖系从铁皮石斛植株里提取出的多糖类物质，经研究发现，多糖是石斛属植物的主要活性成分，在抗衰老、抗肿瘤、降低血糖等方面有很好的作用，在治疗胃肠道疾病、白内障、关节炎、血栓闭塞性脉管炎及慢性咽炎等疾病有很好的疗效。3

1.2铁皮石斛国内外研究现状

随着我国经济的快速发展，人们生活水平的不断提高，人们对健康和精神生活的需求和品位也日益提高，越来越多的人们认识到要用本身健康的东西来健康自己，铁皮石斛是一味功效显著的珍稀药材，具有增强免疫力、消除肿瘤、抑制癌症、润肺清咽等药用价值和保健作用，在国际国内应用十分广泛。铁皮石斛成品目前主要加工成以下三种：（1）铁皮枫斗。通过改进传统的做法，使之从外观、质量等更符合现代消费者的习惯。

（2）研磨成粉末，做成胶囊，以盒装保健食品的方式销售。这个过程并不涉及到药品加工，而申请食品保健还是很容易的。中科院植物所都有这样的技术，且很成熟，只要买批号后委托加工就可以做出成品。这个保健品服用后效果表现为：睡眠安稳绵长，无夜梦。白天精神饱满，无疲态。胃口变好，无便秘。情绪安定，不易急躁和动怒。4

（3）购买已有技术，做成中成药。小规模临床试验证明，在化疗及治疗心血管疾病方面，铁皮石斛中成药辅助疗效十分显著。以片剂口服方式，可部分替代扩张血管的西药烟酸注射液。随着功能开发和应用技术的不断发展，需求量在不断上升，目前是国内近百种药品和保健品的必需原料，全国涉及用到石斛类的制药厂和保健品加工企业有100多家。铁皮石斛主要的消费市场在我国的浙江和上海一带，另外就是港澳和东南亚地区，北京、广州、成都等地近几年市场发展较快，从我国石斛联盟发布的市场信息来看，铁皮石斛的市场和销售都在快速发展。从相关信息来看，目前世界中草药市场销售额为160亿美元，而且每年正以20~30％的速度增长，而我国的中草药产业占整个医药市场的40％左右，近五年来以年平均20％的高速度递增，铁皮石斛所占中草药产业比例越来越高。52.试验目的和意义

2.1试验目的：铁皮石斛多糖的提取分离工艺已较为成熟，但石斛的品种繁多，应开展对其他种的石斛多糖结构的提取分离研究。

本文通过以组培铁皮石斛为材料，以组培铁皮石斛提取出的多糖为主要研究对象，对照组培铁皮石斛苗和维生素C进行总还原能力、清除羟基自由基、清除超氧阴离子和清除DPPH(1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基)能力进行测定。通过此试验拟阐提取出的铁皮石斛多糖的抗氧化功能特性。62.2试验意义：

自由基（freeradical）是一类含有未配对电子的基团、分子或原子，主要包括超氧阴离子、羟基自由基等，是人体内的代谢产物，在正常情况下处于动态平衡，且浓度很低。当这一平衡被打破，就会对机体造成损害引发一系列疾病。

本试验尝试性的以组培铁皮石斛为对象，研究组培铁皮石斛多糖、维生素C和组培铁皮石斛苗清除自由基的能力，为组培铁皮石斛多糖抗氧化性的研究提供基础数据以及组培铁皮石斛多糖的综合开发利用奠定理论基础。

73.试验方法和内容3.1组培铁皮石斛多糖的提取3.1.1组培铁皮石斛多糖提取工艺流程

组培铁皮石斛水回流提取浓缩

脱脂脱蛋白脱色干燥组培铁皮石斛多糖8破碎90℃，1h，料水比1:2060℃，0.75Kpa1h氯仿，正丁醇活性炭60℃3.1.2操作要点(1)破碎：组培石斛苗要充分的研磨破碎，有利于多糖的溶解分离。(2)提取：破碎的石斛组织于90℃、料水比1:20的条件下回流提取1小时，重复三次，合并提取液。(3)脱脂：浓缩液中加入100mL石油醚水浴回流至沸腾，抽真空过滤。(4)脱蛋白：以50mL多糖浓缩液，15mL氯仿，5mL正丁醇为标准比例混合振荡，不加热，离心机离心至离液面交界处无白色混悬物，也就是蛋白质介于提取液与试剂交界处即可，并分别提取。9(5朗)干燥挂：脱禽色后渔的多舟糖液广于烘馅箱中装用60像℃热风产干燥认至恒屿重，瞎保存竞备用率。3.凑2组培毕铁皮租石斛顷多糖迎含量脊的测糟定试验萍采用先蒽酮梅硫酸统法测糖定组焦培铁菌皮石总斛多效糖含葱量。3.顾2.挖1葡萄恰糖标僻准曲巩线的随绘制精密响称取架经10爪5℃干燥羡恒重族的标印准葡能萄糖0.巾05巨g（精魂确到0.含00罪01缎g），帆用温焰蒸馏遭水溶或解，崭并定宏容至10劣00躲m屋L。此听溶液虎质量乖浓度洞为50猪μg遗·m晚L-1。分或别取督上述你葡萄文糖溶允液0滥mL、0.绑4狱mL、0.毫6己mL、0.匠8疯mL、1.猫0需mL、1.怒2住mL、1.鼓4抄mL、1.握6才mL到25延m意L具塞碰试管纪中，仅用蒸带馏水音补足犹到2m帜L；在田冰水暗浴中甩加入4生mL的2g废/华mL的蒽胜酮-硫酸筑溶液透，摇誓匀，娃置于赠沸水取中加营热煮兄沸5m仗in，取听出后讨用流确动水袋冷却乒至室锡温，桐以零祝管为漆空白霸，于62歉5n钩m处测渴定吸盆光度午，以攻葡萄袖糖浓顿度为发横坐心标，巷对应腐吸光赏值为亦纵坐葱标建慈立标汉准曲数线，估如下晌图所都示。103.解2.矮2组培透铁皮奋石斛点多糖站含量晋的测螺定分别示取组姻培铁及皮石旋斛多排糖储做备液(5骂0μ傲g·坚mL-1)和组煤培铁肚皮石蛮斛苗盛储备盗液(5落0μ勒g·证mL-1)1扇.6繁mL到25色mL具塞熄试管魂中，芝用蒸叫馏水平补足触到2m止L；在悉冰水哨浴中览加入4成mL的2g凯/寨mL的蒽臭酮-硫酸依溶液外，摇色匀，然置于绑沸水编中加日热煮热沸5m康in，取侦出后粱用流躲动水线冷却拜至室场温，螺以葡谢萄糖视样品繁中零帽管为白空白辰，于62怒5n敢m处测扛定吸善光度比。由局标准印曲线双求得梯对应如的多板糖浓扣度，柿以葡傅萄糖样计。113.复3菌FR撑AP法测谦定组脖培铁聚皮石衡斛的航总抗末氧化宏能力3.澡3.挪1硫酸涂亚铁舱标准球曲线闸的绘斩制取不楚同体调积5～14躺0μ庭L的1m庆mo筋l/猫LF升eS杆O4溶液肯，用惩蒸馏却水补草足至2m即L，再柏加入悉配制礼好的FR邮AP工作遣液3m傍L，混槐匀后弯于37宗℃反应30叶mi卧n，在59灰3n届m下测里定样医品液四的吸如光度颗值，征确定棒还原浆力标双准曲溉线。以吸管光度驰（Y）对凡葡萄算糖质虑量浓镇度（X）回医归，知得到页回归皱方程y答=造0.弹05尚16变x菠-喘0.驰00痛41，所艘得葡质萄糖锈标准僵曲线芳如下嗽图1所示狮。123.月3.心2组培石铁皮每石斛速多糖杏总抗斤氧化碑能力秋的测晓定分别抹精密怨移取李不同杨样品家质量50～30走0μ企g的3种待驶测样墓品加恒入到容有刻嗓度试钥管中她，加像蒸馏伐水至2m象L，再冤加入FR剑AP工作境液3m粘L，混懂匀后况于37跪℃反应30箱mi鼓n，取态出后须立即扯在59期3n矛m处测折定吸正光度前。以晌不加攀样品千组为刷参照够，测绢定样浮品吸脂光度棋值，鸭每个礼样品测平行脏测3次，纹取平迫均值剃。根裳据还冰原力久标准枕曲线糊，计董算相蔽同吸鼠光度陷值的Fe甲SO4当量按浓度招，记样为FR秆AP值。3.斥4组培敢铁皮俗石斛状多糖夸清除怠羟基缘瑞自由对基的部能力根据Fe凑nt嘉on反应辈的方阳法，拦建立·O屯H自由快基产监生体厉系模就型。在刻汤度试帜管中版加入5m逆L的蒸陶馏水,3窗0μ箩L的0.鹊02像mo五l/满L的Fe惨SO4,1券00优μL答0.报01筛m何ol宇/L水杨坑酸,最后槐加入25能μL这0.胡02舅m速ol挂/L雅H2O2启动青反应,放置37响℃水浴棋保温稿反应30毁m亲in呈,之后泽立即茫在51中0辞nm处测讽定吸原光度贤，作芒为空磁白吸科光度亚值。涉同上少，在秋刻度华试管抗中分章别加互入不衰同系牢列5～60摸μg的样窃品后菠，再加蛇入25明μL乱0.五02冲m谱ol撤/L炊H2O2启动而反应怀，水冤浴恒厉温30执m报in立,之后秧测定皂吸光备度值筛作为奖加样屈品后本吸光伍度值浮。清除痛率=柱[(郊A1-A0)/茶A0]×蹦10钟0%用①式中:A1为加竹入待怨测物据后的视吸光砍值;A0为空谅白对支照的躬吸光再值。133.袜5组培果铁皮访石斛艘多糖潮抑制达超氧迷阴离刘子自衰由基躁的能虏力试验遮中采瓦用邻衬苯三猫酚自储氧化—分光赚光度珠法测碧定抑随制超胡氧阴预离子猎自由句基的储能力罩。加入候样品件前：季将pH昏8.俗2T牙ri喉s-枝HC颠l缓冲律液和50饱m菠mo防l.棍L-1邻苯迎三酚偷在25正℃的恒波温水离浴锅搅中保仓温，晕取5m栋L境pH糕8.集2T网ri堤s-牲HC棕l缓冲办液，糟加30励μL月5锈0m药mo律l/抛L邻苯配三酚坊，摇锡匀，期在32阻5n住m下立束即测梳定。福以pH相8.跳2的Tr敞is悄-H宾Cl缓冲雾液为槐空白织，每净隔0.故5展mi际n测一筒次吸章光值光，计敏算出恭平均忍值A0。加入方样品璃后：摩取5m裤L摇pH傲8.饭2T肃ri孟s-无HC号l缓冲踢液，誓加待墓测样谋品5～60度μ主g、30疫μL帝5泡0m荒mo刃l/两L邻苯引三酚棵，摇呀匀，码立即流同上租测定蜡。以pH抢8.讨2T辞ri熄s-奋HC特l缓冲副液为透空白榆，每叠隔0.千5唐mi横n测一殃次吸撤光值藏，计神算出龄平均猪值A1。抑制捧率=料[领(A0-寻A1)/阶A0]遍×1拖00废%盘②式中敏：A1为加溜入待羡测物饰后的福吸光煎值;A0为空奥白对框照的屈吸光之值。143.仇6组培圈铁皮镇石斛盯多糖蹲清除DP绿PH自由蓝基的岁能力3.叙6序.1匪D打PP赏H标准吐曲线搬的绘丛制精密驱称取DP翼PH樱0.印02汁02捧g，加笋甲醇变溶解宗定容仪至50帮mL，作师为储望备液虚。精抱密移纺取上侵述储荷备液10短mL至10煎0m许L容量漏瓶中凉，定肉容得40蛇.4晚mg丈·L－1的储净备液姥备用碌。分姜别精危密移掘取DP本PH储备亏液0.闻2m刑L、0.蚕5m搏L、1.遮0m城L、1.概5m拴L、2.经0m勇L、2.敬5m捆L、3.晶0m喝L、3.裂5m业L、4.怨0m甚L于10菜mL刻度遵试管坛中，抚用甲痰醇定役容至播刻度脚，摇南匀，沾以甲赤醇溶翼剂作中参比英，在51戚5n需m处测奸定各郊溶液革的吸环光度酱。以DP淡PH的质禾量浓想度为咸横坐良标，加吸光翅度为研纵坐尽标绘栏制标钉准曲蒜线。配制DP摄PH标准暗溶液荐系列青，绘困制出DP巷PH标准迫曲线箩见图6。标恰准曲霸线线盖性回注归方皂程为y凯=仓0.销02在08碍x改+撞0.岩00配09，在DP幕PH质量膀浓度丸为2～16痛mg榆·L－1线性仓关系拆良好侨。153.殖6.本2组培亭铁皮间石斛同多糖咬清除DP流PH自由励基的曲能力分别难在1.喜0m蹦LD丹PP府H储备贞液中均加入使不同侄质量(2藏00～80剪0μ幼g)样品植待测栏物，补用甲状醇稀露释至泳总体梅积为3.韵00监mL，混却匀放徒置40昼mi伸n后，层用1c驰m比色孩皿于51绞5n纤m处测矛定吸光光度穴，根攀据DP盏PH标准计曲线检回归智方程漠计算DP畜PH质量轻浓度泻，按遮下列梳公式侍计算DP建PH清除泡率(Y痒)。Y=卫(1勺-Ct/C0)×澡10悟0%坟③式中:C0为反撤应体支系中DP挤PH的起扛始质买量浓离度(m掉g·予L－1);Ct为40丑mi驳n后反雄应体床系中DP吴PH的质脾量浓凶度(m仙g·南L－1)。164试验搅结果4.外1组培并铁皮骨石斛啊多糖嫌提取捡结果洽：组培惭铁皮袜石斛斗苗在吐捣碎粉情况缠下于90慨℃、料虚水比1:友20、1小时物条件喂下浸焰提，沿重复笑操作增三次马，最浸后得矮组培纹铁皮挡石斛丙多糖伤得率践为4.婚25％。4.如2多糖零含量震测定纠结果冒：将组愿培铁锻皮石锻斛多县糖和冲组培是铁皮剥石斛海苗用潜蒽酮-硫酸挑法测族定多传糖含跪量，亚组培绍铁皮散石斛垫多糖由和组优培铁营皮石咳斛苗挤中多奥糖的心纯度睡分别树是：73循.1绵5％，10恢.5巩1％。替由此蹄可见庸，组顿培铁洪皮石盒斛多特糖中鲁可被土检测虾到的衣多糖晌明显均超过顶组培绍铁皮痕石斛碎苗。174.灵3给FR罩AP法测嚼定组监培铁恼皮石挤斛的总抗膏氧化酬能力结果秒：由下践图可踏知，进当样过品加胜入量木在50～30结0μ真g范围沙时，抄随着丘组培杯铁皮谜石斛形多糖物、组酷培铁京皮石达斛苗鼻及维冰生素C加入街量的懒增加绵，其汪总抗室氧化楼的能闷力也拼随之侄增强捏。组犁培铁根皮石庆斛苗炎的抗胡氧化匹能力牙最弱涝，组遥培石腊斛多栋糖抗谢氧化悲能力把相对石较强确，而姓维生妨素C的总水抗氧套化能妥力优浸于组踩培铁纲皮石欺斛苗察。总东体说剂来组魔培铁凤皮石梯斛多与糖的辞总抗汽氧化湾能司力明横显比受组培蒜铁皮胡石斛劫苗强留得多晶。184.外4组培特铁皮繁石斛注多糖嗓清除羟基润自由招基的能住力测着定结果忌：依据Fe慌nt插on反应脚体系调建立布的清清除羟舒基自随由基苗能力规，其置结果插如下财图所讲示。由图君可知碍，组宏培铁排皮石晚斛多脊糖对深羟基创自由妈基清解除能杨力高姓于其蓄余样考品，什维生病素C对羟我基自轿由基盾清除盛能力谎相对装较低样，而烂组培欣铁皮振石斛豆苗对亲羟基枣自由奶基清颂除能固力最商低。荷由此骑可知透，组千培铁北皮石谜斛多嘉糖对端羟基坏自由聋基清多除能铅力较斗高，足而组均培铁蹄皮石舱斛苗馒对羟阅基自组由基围清除例能力月相对误较弱饿。194.协5组培设铁皮编石斛浙多糖抑制内超氧块阴离浸子自由粱基的察能力敢测定结果粘：不同晨样品旦抑制润超氧奖阴离子阁能力夫如图所示勇。由图孤可知裙，三啦种不禁同物漂质都具酿有一讽定的针抑制喂超氧宰阴离子新自由幅基的挤能力俱。随偿着样品红含量坛的增踩加，贿样品液抑制超淋氧阴劲离子催自由虹基的畜能力不宪断增迎强。盲组培浸铁皮凝石斛然苗抑堤制超洽氧阴跨离子得自由他基的坝能力迟相对勤较弱师，当征样品大加量芽为10诸μg时，半对超肤氧阴远离子源自由咸基的挡抑制杂率仅术为3.歉48在%，加重样量岭增大谋到60床μg时，浇抑制箭率也年仅为23积.4年7%；组膜培铁母皮石野斛多誓糖抑遗制超抛氧阴亭离子束自由止基能盼力相界对较炸强，藏即当社样品箭质量蓝均增阻加到60湖μg时，爹组培摇铁皮梨石斛周多糖恨抑制辅超氧布阴离饰子自耽由基欲能力旺达到班了47钟.0石8%，维阁生素C次之却，抑仿制超跪氧阴变离子能自由久基能航力达会到了44艳.1挪9%。204.授6组培宽铁皮犁石斛愧多糖摇清除DP阔PH自由斜基能力远测定暑结果久：根据燃标准叶曲线陕，得凝出三顺个样碗品清漏除DP类PH自由严基能退力如露图所照示。由图坝可知裹，随念着反堆应体刑系中字加入新组培漂铁皮犬石斛资多糖饱、组妹培铁射皮石蹄斛苗价及维残生素C的质肥量愈俯大，其敢清除DP糕PH自由弦基的壶能力辛愈强积。对赖不同杨样品害物质可所表肌现出贫来的捆清除DP景PH自由筹基的片能力占有所筋不同刃。实辛验结免果表接明，薪组培粘铁皮较石斛局多糖羽清除DP希PH自由越基的壤能力努相对叛较强徐，当元石斛唱多糖袄质量跃为70泥0u枕g时，毫组培校铁皮朵石斛败多糖束清除肠率达级到51锄.9占1%，而饼其他斧两个旗样品格对DP经PH的清采除率缸效果勺均低回于组访培铁泳皮石佛斛多慎糖。215.结论愿与讨架论5.贸1结论谦：(1奸)通过粗研究黑表明垂，将火组培陕铁皮饼石斛主多糖务和组钉培铁牵皮石腐斛苗饶用蒽福酮-硫酸棋法测腰定多爱糖含竟量，怜石斛闸多糖刃和石枣斛含享糖量历分别役是：73侍.1介5％，10深.5立1％，娃组培告铁皮心石斛薄多糖释中可碧被检念测到香的多构糖含服量明讲显超益过了译等质轿量的爬组培沉铁皮抗石斛具苗；绒由此按可见疑，我宝们将哥组培杜铁皮躁石斛懂中的插多糖糠进行出提取理纯化踩，进氧而应新用于辉食品男加工底中，酸具有观重要痛意义焦。(2器)三种耍不同撒样品伐的浓伏度愈和大，炭清除军羟基张自由延基的匠作用娇愈强铲，其氏中组迅培铁杯皮石盟斛多窃糖对川羟基蚂自由兴基清门除能筹力较牙高，盯当加财入样卵品质暂量达屋到60唐μg时，跪清除绪率达趋到91丽.4芬0%，而凶维生族素C清除传能力蛾相对见较弱殖，组具培铁墙皮石锦斛苗皮对羟郑基自芹由基杠清除谈能力零相对遮最差馆。(3组)随着税样品衣质量磨的增筒加，链抑制卫超氧搂阴离相子自脱由基伯的能再力增伤强，饲组培柱铁皮统石斛横多糖贴当其误质量英达到10魂μg以上饿时，秋抑制竟率达膨到22棉.1弄2%以上牙，组淹培铁挖皮石籍斛苗高抑制稠超氧蕉阴离虚子自舱由基裳的能锄力也称相对驳较弱绘，当赞其质巧量达放到10怠μg时，贵其对瓶超氧挎阴离方子自拢由基粥抑制牛率仅眯为3.辈4处8%，维蓝生素C抑制欧超氧纳阴离倍子自县由基址的能托力相押对好圈些，原达到6.究08降%。22(4拜)采用DP乞PH法对车组培肤铁皮茄石斛坡苗、浩组培在铁皮温石斛秩多糖片及维棍生素C进行械了抗删氧化塔活性义研究君，发傲现组伍培铁正皮石咏斛苗奸、组激培铁盯皮石柏斛多识糖及杯维生咐素C在低宜浓度渴和高牲浓度短时，店均有暂一定流的清灾除DP屈PH自由胜基的邀能力碎，当械质量辛增大农到40帅0μ炮g时组晃培铁镰皮石蓄斛苗婚清除晴率高胶过维根生素C，当考质量熔增大豆到70哲0μ岭g时维市生素C清除盗率高圣过组效培铁摇皮石底斛苗绪达45米.2丛7％；唇铁皮公石斛捕多糖誉清除DP延PH自由各基的扇能力法一直蓄高于关另外浅两个徒样品艺，当汤质量摸增大临到70遮0μ画g时清站除率距达到51掉.9悄1%。5.作2讨论厦：(1袋)在组泡培铁孩皮石悔斛多币糖的删提取椒过程阔中，粗恒温型萃取付和真魂空浓违缩都富涉及述到温扯度的汗控制驾，在帽实验手过程夏中应兽严格盐控制位温度化。通用过查逗阅资咬料得香知铁乱皮石名斛多般糖不鞋耐高慎温，多高温对会使扎多糖仙氧化怠分解宗，从要而影柔响试麦验数桑据结缝果，驼所以毒在多燃糖提订取过食程中锄对温忙度的怕控制炉要格贪外认设真、滋仔细完。(2涌)制作叛硫酸证亚铁致标准冤曲线康和样谊品总宇还原偶能力危测定招时使林用到FR牧AP工作替液，椅该工疗作液排要现妙用现钱配，示否则席会产乘生絮呢状物敌，从悟而影血响试蜜验效下果或达数据翠。23(3巩)在测浸定三臂个样助品抑抱制超赞氧阴睬离子剪时要腰准确恋把握昏试验而过程协中试屠剂加续入的稀时间耽，保购证是珍同一育个人贯操作啊这个斜过程律，减查小因币为个币人操棚作不深同带甚来时泉间把篇握上惯的差型异。纺因为悠此实恨验过遥程中赤要求维配好京溶液洗立即玩测定完，每衔个样材品测尖定三滑次吸滴光值驳，且粘每隔30秒测保一次野。因结此，受在操够作时时不能勇等所康有样译品加倾好后斩统一备测定沾，这私样得抖出的框试验赤数据谢就没聋有任岭何意居义。(4誓)通过拉测定顷三种熟不同盟样品见清除诸自由淘基能桨力的爸结果沟表明该：不铸同样睡品物享质在道清除纳自由核基时米，部天分低掘浓度劲清除阳自由泉基能左力相地对较岭低的倡样品污物质搁，随猴着浓忆度的键依次朋增大胃，其毫对自症由基娱的清漏除率珍会高衰于原腰本低径浓度矩时相角对较跑高的衫样品纹物质恒。这田可能壁是和载不同煎样品震物质啊在不您同浓机度下谦对自新由基惊清除陵能力从强弱给有关蓬。24(5准)总体便说来点，本血试验煮通过事对组肤培铁烧皮石姐斛的倚多糖杰含量咳进行敢测定呈以及脆其抗