第八章大肠杆菌基因表达系统

第八章大肠杆菌基因表达系统克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。一、原核表达系统的注意事项外源基因不能带有内含子。2.必须用cDNA或者是化学合成的基因。3.不能直接用真核基因组DNA。4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件：1.强启动子、强转录终止子2.可诱导性3.合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等二、理想原核表达载体具备的基本特征AdividingE.coli原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子①必须是一种强启动子②应呈现低水平的基础转录③应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件基因工程常用的原核启动子PlacO目的基因乳糖启动子lac色氨酸启动子trpP1OtrpE目的基因cI857:噬菌体启动子是PL42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录cI857PL外源基因28oC时阻遏PL，外源基因不转录。三、巷外源匠蛋白题在大筛肠杆丙菌中旺的表胡达部蛮位1.细胞吼质中肃表达（1）包昨涵体敢（in木cl慎us挠io梁n吨bo赤dy）是存缠在于秤细胞盯质中礼的一顷种不溶浸性蛋寇白质聚集华折叠票而成途的晶孤体结港构物族。形成针原理闯未知淘。使重塑组蛋蝴白易换于分殊离、币免受奇蛋白衰酶降眠解、钱不损楚害寄列主细用胞回收违的蛋每白生著物活群性差盼。②受缺点①登优点2.周质斑中表哄达（1）周齿质（pe收ri况pl彩as讯m）格兰茧氏阴增性大沉肠杆悬菌位墙于内净膜和该外膜梢之间占的细遍胞结滤构部疑分。优点盘：容易爸被浓煮缩和索纯化生、有株利于概正确灶折叠宁、被村降解若的少旁。ph腿oA、Om浆pA、Om判pT、Om漏pF、La筒mB、β-内酰间胺酶昏（la谎ct眨am具as列e）（3）常滔用的塞原核代信号鸡肽①大肠精杆菌忆的信但号肽贼：能带钟领蛋功白穿矩过膜政到达把周质缘瑞。但紫以后湿需要跳正确诸切割落掉。（2）信插号肽馒（si景gn生al推p皱ep店ti会de）一般胁位于N端。②金刮黄色握葡萄住球菌川的蛋翻白A。鼠源RN王as顺e、人生仰长激脱素信暗号肽蒸。也能旨在细在菌中游起作蛋用。（2）真核破信号伟肽用溶观血素菊（he询mo火ly雀si坊n）基因撞构建刘分泌语性融抵合蛋右白；使表悬达的邀外源昏蛋白分泌携到细王胞外的培葵养基娘中。3.胞外寸表达或与殊细菌统素释讲放蛋疼白（ba改ct生er趋io口ci雀nre廊le泳as俘e粒pr背ot链ei黑n)共表酸达。载体骂表达框出的犹外源罢基因推蛋白鸡质不丑与细层菌的享任何寺蛋白俩质融城合在凤一起谅。S-震D序列AT概G-外源伟基因-T犯AG优点折：四、柏几种躲类型健的原租核表哈达载命体1.非融破合型联表达膝载体缺点硬：产物俗结构累接近竹于真柄核细醉胞体麦内的短蛋白舌质结雁构。容易捧被宿骆主菌喉的蛋让白酶转所破栋坏。哈佛深大学忌的Gi挡lb里er芦t实验膀室建父立的亦。表庭达能赖力强淹。pK少K2设23粥-3载体组成科结构永：条件钞：必须嗽选择拥一个伙有la蜡cI的宿么主菌众。ta筐cPLa瞎c蹄OS-刺D插入枝位点难区rr已nBT宿主la姓cI表达慈诱导亩物：IP膛TG（乳糖赔的类脂似物顷，不煌会被押降解此）阻遏犯物IP袭TG载体熊表达精出的粱外源刻蛋白齿质与展细菌遮的分屿泌信肉号肽祖连在壁一起绒，可距被宿遍主菌佛分泌摄到细逗胞周送质中耕。如：pI亚NII织I系列浴：2.分泌欧型表税达载尚体pI承NII往I-链co划mA奏1,pI俘NII习I-戚co霜mA协2,pI淋NII币I-委co揪mA腿3,Om如pa：大肠著杆菌学外膜税蛋白菠基因IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位点组成穗结构Ip听p：脂蛋最白基跪因启可动子pI知NII送I-逮co军mA1以pB象R3敏22为基肾础构武建的深。调节假基因扭不必洽借助直于宿章主的la蛇cI.表达图出的今外源晕基因器产物忧蛋白醋是与遥质粒寒载体绣上的穷菌体抄蛋白抬连接刘在一拆起的食。3.融合彩蛋白喝表达档载体娱系统--线--pG欠EX系列（1）优宇点便于掘融合钻蛋白阴的分衫离和爸纯化尼。la赵cIta同cla络cOS-喉D/艳AT昆GGS够T插入嫩位点TG百Ala垄cP融合染肽：GS漏T(谷胱程甘肽秃巯基磨转移泪酶）GS擦T融合络蛋白太用Gl执ut须at帐hi敢on横eSe周ph挖ar壶os阳e亲和压层析呈柱分离洗纯化普。（3）产由物提伯纯（2）组映成结行构（4）产扒物分嚷离用凝御血酶拜或Xa因子县可以寻把外掌源蛋骨白从GS救T上切廊下来爱。柱（co递lu翻mn）GS季T外源杰蛋白凝血聋酶外源返蛋白柱（co狡lu埋mn）GS院TGS扒T洗脱柱（co文lu缘瑞mn）可再纷利用pG械EX插入渡区：pG岭EX喝-1TCT动G镇GT抹T速CC乐G色CG咬TGG越A党TC励CCC型GGA竿A黄TT拐CAT罗C题GT哭G翼AC值T舍GA些CTG摧ACG妥ALe拼uVa污l紫Pr浆oAr旧gGl客ySe备r沸Pr优oGl聋uPh调eIl借e兆Va涌lTh剑rAs缠pEc斯oRIBa仗mHI凝血葡酶CT尾G宋GT破T喝CC英G谊CG竟T潜GG抚A佩TC中C株CC间G填GG素A巩AT榨T偶CA低T脉CG捧T跨GA污CTG爹ACT怎GA会CGLe踏uVa拴l断Pr会oAr资gGl授ySe晌r悬Pr酸oGl蝇yIl绒e钟Hi露sAr衬gAs禽pEc泉oRIBa苗mHI凝血仪酶AT薯C绸GA绪A敞GG巾T互CG腊T插GG省G炼AT粪C月CC己C摊GG壮G赴AA延T方TC含A颂TC毒GTG州ACT掀GA兰CT贯GA凉CIl白eGi蒙uGl叹yAr男gGl努yIl要e刻Pr垦oGl绸yAs四nSe来r且Se经rEc刮oRIBa疑mHIXa因子pG施EX幻玉-2溪X的插伍入区雀：pG胃EX猎-3驴X的插地入区望：Sm扛aISm析aI（5）其辞他融挣合蛋奏白系隆统Hi辨s-报ta凭g（组金氨酸换标签啦）：在外邮源多裙肽的N端或C端接税上6个组垄氨酸（Hi骆s）。Hi滨s-裙ta清g能与Ni2+柱结合晌，但柿很容熟易被ED底TA（或堡咪唑枯溶液瓦）洗弊脱下该来，抗可以中纯化墙蛋白课质。（2）-3共5区与-1淡0区之钟间的肥距离（1）-3私5区和-1灰0区的核碱基滴顺序五、顶影响助外源赴基因悼表达斥效率垃的因健素1.启动词子的哥结构搏对表每达效螺率的渣影响5’-TTGACATATAAT一致顺序lactrpPLrecAtacItacII5’-TTTACATATGTT5’-TTGACATTAACT5’-TTGACAGATACT5’-TTGATATATAAT5’-TTGACATATAAT5’-TTGACATTTAAT5’脉-A际GG绝AG董GU序-3羡’S-洒D序列贯后面庆的4个碱典基：如果洗是A（T）,翻译镇效率糠最高涨；如果激是G（C）,效率厅只有50蹦%或25淡%。2.翻译遗起始疼序列撞对表吃达效样率的脸影响（1）S-屯D序列？？翻？？AU注G左侧也的三振个碱缩慧基也贪有影敌响。（2）起旋始密奥码AU岩G-半乳握糖苷诉酶的mR劈燕NA中：AU跪G左侧谅如果蚕是UA泊U或CU期U时，谁最为故有效吴；如果喉是UU奇C、UC闯A或AG汇G时下手降20倍。3.启动床子与建外源露基因掀之间虚的距推离3.启动虚子与思外源验基因夕之间扯的距胆离4.转录昼终止墓区对球表达尽效率慕的影哄响5.载体桐拷贝证数及泼稳定烘性对秒表达聚效率宽的影抗响6.外源翻蛋白才在菌清体中扮的稳像定性离对表塑达效林率的但影响选择削强启惹动子佩序列权，如ta咱c等六、捷提高始表达贺水平键常用到的方糕法2.调整S-益D序列坡与AU裙G间的严距离3.改变让起始以密码鲁下面攀的几类组密始码子一般质为5-絮9b异p。能提饲高翻讽译的锻起始崭效率史。4.增加mR挤NA的拷股贝数轨和稳皮定性“重复彻性基第因外丹回文侮序列”能踢防止mR送NA受到3’5’外切困酶的泪攻击雄。5.减轻猎宿主真细胞突的代请谢负被荷合理格地调忌节代姥谢负秒荷与晨外源筝基因葵高效酸表达眉的关衡系。将宿奴主生白长代辈谢与妨外源域基因旧表达川分开庆。（1）诱舅导表包达一般卖采用朵温度醉诱导亦或药兵物诱颠导。cI贵85望7阻遏悬物有运活性稿，抑陪制PL启动街子，闷外源威基因稻不表堵达，公宿主立大量密生长和。32°C蜜:42°C处:cI店85晓7阻遏痰物失暖活，PL启动踏子启墨动，挑外源闪基因拴高水粪平表谜达，江宿主挺生长颤受到谢限制鞋。cI鸭85固7PL外源熔基因POPL启动较子是耀温度身诱导钟型调节认基因la捞cI（位于掉宿主设基因验组内鲁或载顿体上仅）始她终产狮生阻宴遏物诞。无I才PT乌G:阻遏改物与la禾c操纵缺基因顶结合捎，抑色制外扭源基仆因转捧录。悦宿主乖大量械生长敞。有I密PT遵G:阻遏龄物与IP贿TG结合扁，la什c操纵假基因性解放咬，外验源基揭因大泛量转敏录。禾宿主壶生长旨受抑叠制。ta辉c启动轰子是绕药物近诱导柳型（2）表台达载柄体诱穿导复童制将宿房诚主的扬生长招与载报体的动复制舰分开导。当宿首主大梅量生长访后，再普诱导轮载体捷质粒明的复装制，焦增加丢拷贝您数。当需扇要宿砍主大贿量生长年时，抑端制载庄体质专粒的毕复制巨。N末端吵：由撇原核文基因舟编码惕一段位多肽白，C末端壤：是农完整舟的真距核外璃源基粘因。（1）设技计成殿融合族蛋白质粒贼基因周产物目的语基因波产物NC切割6.提高特表达