生化实验凯氏定氮法

实验06

植物组织中总氮含量的测定

（微量凯氏定氮法）1

氮素代谢在植物新陈代谢中占有主导地位。测定氮素含量对于研究植物的氮素吸收、运输和代谢规律，以及确定农产品品质、营养价值等均具有一定意义。动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类，主要以有机氮形式存在。由于蛋白质的含氮量相对稳定，测定出样品中总氮含量，再乘上一个系数即可得出样品中粗蛋白含量。如要准确测定蛋白质含量，则需利用三氯乙酸将样品中蛋白质沉淀出来，再分别测定蛋白氮和非蛋白氮。组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。2一、原理在催化剂（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的条件下，将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解成CO2和H2O，其中的氮转变为氨，并进一步生成(NH4)2SO4，这个过程称为消化。在消化后的样品中加入过量的NaOH，经强碱碱化使之分解释放出NH3,通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液中生成四硼酸铵；再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。3一、原理

以甘氨酸为例的化学反应式：消化：CH2NH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3

2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4蒸馏:(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3↑2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO34材料：面粉

仪器设备：消化管、分析天平、微量凯氏定氮蒸馏装置、容量瓶、三角瓶、滴定管、移液管、消煮炉等。

试剂：

1.浓硫酸（AR级）；2.30%（W/V）NaOH；

3.30%H2O2；4.0.01mol/LHCl标准溶液；

5.2%硼酸溶液；6.混合催化剂；

7.混合指示剂；8.标准(NH4)2SO4溶液二、材料、仪器设备及试剂5凯氏定氮蒸馏装置全自动凯氏定氮仪6三、实验步骤1.样品消化（已完成）准确称取样品（依其含氮量而定）至消化管中，加入5mL浓硫酸和混合催化剂，浸泡数小时后在管口盖一小漏斗，放在消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低，加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温，使消化管内液体达到微沸，直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。在消化过程中，可分数次加入少许H2O2以加速有机物氧化。如发现在消化管上部有黑色颗粒，应小心转动消化管，用消化液将其冲洗下来。整个过程一般需3-4小时，均应在通风橱中进行。72.定容：

消化液冷却后，沿管壁仔细加入10mL左右无氨蒸馏水以冲洗管壁→冷却后转入100mL容量瓶，再用少量无氨蒸馏水冲洗消化管数次，洗涤液一并转入容量瓶→冷却后用无氨蒸馏水定容至刻度，混匀后备用。3.蒸馏

（1）仪器洗涤：在蒸汽发生器中加入2/3体积蒸馏水→关闭汽水分离器阀和进样漏斗、并使管道联通→打开冷凝管→打开电炉加热蒸汽发生器，用热蒸汽通入仪器各部分清洗15min。蒸汽发生器安全管反应管隔热套冷凝管收集瓶导管汽水分离器进样漏斗密封阀83.蒸馏

（1）仪器洗涤

冲洗完毕，从加样漏斗向蒸馏反应管加入无氨蒸馏水，清洗蒸馏反应管→打开汽水分离器阀、夹紧蒸汽发生器与蒸馏反应管之间的橡皮管，由于冷却减压使得反应瓶中废液被虹吸进入隔热套中→打开隔热套下端的活塞阀排出废液。如此清洗2-3次。

可将冷凝管下口浸入硼酸-指示剂混合液中检测清洗效果，当硼酸-指示剂混合液不变色时，表明蒸馏装置清洗干净。93.健蒸腿馏膝（慰2）玩样品荐蒸馏在三经角瓶猫中装焰入2补0m迟L硼维酸-副指示昨剂混苏合液须（此短时应的为紫图红色润，如对变为跑蓝色群，应猴倒出尸重装弯或清必洗三枝角瓶狗）承疾接在径冷凝促管下逆端出漏口，汁将出闷口浸璃入在倘溶液愚中→打焰开隔须热套矮下端吵的活敌塞→准确塞吸取虎10拘mL其样品皇消化弃液通延过加姿样漏痰斗加狮入蒸地馏反成应管虎中→通过帝漏斗满加入搂10反mL陪N戴aO糟H溶商液→用少堡量无予氨蒸免馏水姜重复好冲洗增漏斗倘3次→塞紧普漏斗季塞，陕再在坏漏斗占中加棚入少肃量蒸杀馏水怪密封封漏斗→关津闭隔座热套清下端锋活塞借和汽降水分宾离阀象，打炊开蒸营汽发羡生器美与蒸泡馏反烫应管吵之间恭的橡进皮管诵夹，开羽始蒸巧馏→观察轻硼酸侵-指需示剂伍混合徐液颜臂色变刃化，滤从颜浊色变谈绿起伴再蒸强馏3驼-5寺mi鸟n后滔，将絮三角惕瓶液拣面移绒离冷累凝管巾下口赖约1竟cm→继续朽蒸馏呆1m状in疲左右嚼，结荡束蒸誉馏。103.么蒸埋馏轧（貌3）混空白疏蒸馏用未幕加植六物样形品的霞消化侍液（岔其余睛试剂仇都加自入并驾按同丝式样方责法进烤行消苍化）激为空混白液春，按挎样品捐消化损液的烦蒸馏屋方法却进行写蒸馏京。4.纸样装品及立空白烈滴定样品因和空似白蒸蔽馏完锋毕后景，分肠别用例0.颈01摩m黑ol酷/L爱盐酸阀标准湖溶液狐滴定丢，直挎到硼抛酸-检指示地剂混公合液堤变回燥淡紫够红色少即为慨滴定词终点宵，记酒录滴雕定样钟品和术空白识蒸馏脖液的弃盐酸联用量盗。纹（滴定地空白狮蒸馏栽液的等盐酸搜用量烧一般撞为0南.2粱mL）11W=雨g烟（根及据样酬品管逐编号坑在讲紧台上轨查表孕获得可）；VT=谎m仿L;春Vs皱=锣m蜜L;届A=系mL拢；B轰=0.像2mL四、险数据锈记录五、继结果害计算样品扑总氮啄含量桃（%功）=面粉粗蛋业白含倚量（迁%）威=样组品含忆氮量弦（%菊）×5.简70（C：寄滴定搞时标面准盐厉酸溶拣液浓昏度（嚷0.贝01绳00罚mo倒l/联L）；VT：消膏化液胃定容衫总体把积（规mL熊）；微W：逝样品贩质量末（g报）；挤Vs：蒸栽馏时械取样繁体积由（m以L）浮；A参：滴复定样鸽品所岂用盐疏酸体妥积（劣mL湿）；妥B：年滴定宝空白疯所用盐酸磁体积赔（0学.2槽m运L））12为了袖熟悉觉蒸馏竖和滴燥定的贺操作员技术剂和检福验实银验的勇准确舍性及杆误差孟，常姥用已谁知浓拌度的庄标准通硫酸续铵溶惯液测糠试3次；每次测蒸馏仅前均龙需清亮洗蒸活馏反扇应管至；在蒸干馏过棵程中咱，不能地同时胃关闭遥汽水袖分离暗阀和神蒸汽保发生腔器与雹蒸馏东反应旦管之凯间的饼橡皮惧管夹牛；定氮禁仪各枕连接咏处不员能漏伐气。注意遮事项释：13实验叹07抗坏断血酸亿（V佛c）苦含量晕的测掠定标（滴余定法级）14一、饼原理Vc允具有妨很强赏的还蜘原性商，染拴料2蔬,6幕-二羽氯酚浇靛酚偶具有青较强膏的氧示化性第，且涛在酸萄性溶斥液中太呈红懒色，括在中艇性或恩碱性陪溶液霜中呈勉蓝色灾。用秩草酸奇提取渣Vc啦，然嫌后用尖蓝色堵的碱耕性2驼,6惩-二样氯酚呆靛酚劝溶液裙对其蓬进行芦滴定粉时，晴Vc刻可将朽2,衫6-阻二氯汗酚靛弓酚还继原成氧无色腰。但袄当V歼c被虚消耗吉完后漂，再劳滴入则少许述2,亮6-物二氯腔酚靛稍酚就负会使告溶液俘呈现弟红色善，借礼此可隙指示膛滴定划终点框。根轿据标影准2蜂,6哥-二受氯酚歇靛酚纷的用延量，傍可以历计算即出被吼测样达品中幸Vc猎的含辅量。抗坏依血酸挪又称揪为维侨生素幼c（妨Vc粪），担在一添般水驻果、预果蔬弦中含敌量较蜂高。短测定吧Vc新含量绒，可泛作为茄衡量合果蔬慰品质哄指标矩之一侮。15材料善：苞纹菜或炸其他聋果蔬亿仪参器设侮备：未蒸发绝皿、涉天平淘、容智量瓶宁、研谜钵、疲碱式轨滴定雕管、踏漏斗魔、移洞液管腿等阅试剂养：挠1拖.虏2%钞草酸核；催2.捡碱购性2时,6袜-二颤氯酚轮靛酚饿溶液毒（蓝村色）及；淡3季.滑0.遍1m势g/洋mL扑标句准V笋c溶铅液（用草恩酸配迫制）二、潮材料仆、仪男器设任备及果试剂2,现6-罚二氯疏酚靛妇酚溶惹液（蓝樱色）16三、实许验步朵骤1.怖样单品提易取准确秒称取客3g尊左右仇样品拔放入仔研钵型中，侦加入叼2%草酸溶液麻约5询mL介研磨→匀浆乓液转疮入5广0透mL茂容量絮瓶，教用草酸洗涤修研钵呆3次歉，洗腥涤液唱一并也转入让容量绪瓶中→用草酸定容墙至刻辉度→过滤鲜，收觉集滤赔液，串备用败。2.锈空醒白滴漏定取2悔%草晌酸1沈0泡mL丑至蒸竖发皿惜中，以用2威,6锡-二材氯酚尾靛酚闯溶液好滴定驻至粉劫红色也，并尿在3你0s狭内不辜褪色燥为滴忌定终滚点，歪记录制染料汪用量傲。17三、实餐验步屋骤4.累样疼品滴口定取滤症液1尿0纸mL伐至蒸国发皿竹中，餐用2,烟6-茂二氯打酚靛幸酚溶敲液滴定税至粉抖红色鸭，并蛛在3票0s身内不鹿褪色贷为止赛。记弊录染钩料用谁量。3.宴染短料标忧定取1捕0没mL费标准章Vc证溶液裕至蒸溪发皿旱中，困用2,杀6-浪二氯使酚靛津酚溶限液滴定渠至粉可红色婚，并载在3仍0s岸内不洋褪色番为滴下定终高点。浩计算笨1m膛L染颤料相扰当于源Vc怎的m静g数英，即滴定溪度（援A）。18W=咏g；腿V1=须mL波;药V0=赵mL苦；烤VT=荐mL煎;候Vs=渗mL四、钳数据秩记录五、旦结果时计算样品昼Vc门含量溪（m折g/柴10辽0g姻）=（苹A：勾