胚胎干细胞培养SOP

胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP)一、细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白EGFP）的B5-ES由Dr.Nagy的实验室制备。2．D3-ATCC;CRL-1934.我们得时约传了17代。3．J1-由Dr.Jaih的验友供我到大传了7－9。4．J1t-tA达1由Dr.Jaenish的验友提。5．表达色光白的YC5-ES胞，由D.Nagy的实验室提供。二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白病制因）高培基来止胞分化。细提包被有0.1％明胶的平板为粘附细的基质。议每2－3天从达到80％－90％融的板按1：8的率传代细一次，胞传代以，在将细胞种在0.1％明包的皿前通先细接在经过包的织养板2小使化胞，而分和化胞开。将胞程于37，5％2，100％湿条件培。培养基ES一20×不含DMESESGRO溶该也用于EB培养基在50mlFALCN为2×管42ml存在0将21ml该溶液HS和ESGO入40lMM中培养基，02μm膜滤贮于4℃。注：一瓶DMEM是500ml。贮存液DE高糖)（HS）L-谷氨酰胺200mM）MEMNEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇Mm）PESTESGRO复苏细胞细胞被冻存在10％二基砜（MO）中防止晶的成，晶形成损害细。然，二基亚对胞有性，速的行胞复是很要的。步骤1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2钟（或放管内溶液好完全溶）；3．将细胞转移到一15mlFacn；4．加入5mlS；5心3；6用lES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。冻存细胞冻存液90％HS和砜：1．1PBS细并许PBS在皿；2．用刀胞；3．将入15mlFalcon管内并离心3分钟；4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中10cm的培养皿用2ml，15cm的培皿用6～7ml）5管1ml；6．置80℃过夜第二移入液。明胶包被准备500ml0.1％液1将0.5g明溶解在500ml无钙镁的PS（0－65℃水浴15～0分。2过m滤膜过，存在4℃。包被养或养皿1（15cm养加2mlm加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了）；2．置室温30；3，。细胞传代建议每2－3天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞纯化步骤包含在下面的方法中。1．去除培养液；2．1×无钙镁PBS洗涤；3．加入1×胰酶EDTA(10×胰酶EDTA用PBS稀释)37育5。4入ES养基胰失；5．将细转入15ml离心管中离心3mi；6．去除上，将胞重于2mlES养，少打10－0。。ES胞成团向传程细弄开要能少的然分。7．将种有的养（和同格养皿放箱2（分化细胞在该时间内将黏附而ES细胞仍将保持悬浮；8．将含有细胞的培养基转入明胶包被（见下文）的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提--S胞有集成的倾）9．建议按1：41：10的比率传ATC)保持胞传比很要以们经，1：8比率好的可以细胞的自然化降最低当你用不规格培养进行细传代以使表1来计算代比。三、体外分化多能胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bF的情第4第5在37，5％2，100％湿度条件下。时间线（总时间为2～34天）第2步41天；第3步：4～0；第4：4；第5：0～15天培养基EB配一20×不含DMEBSSRO于ES培养基在50mlFALCN为2×管42ml存在0将21ml和50mlS入M中制备基，0.2μm滤膜过滤。贮存于℃。注：一瓶DMEM是500ml。贮存液DE(糖)清L-谷氨酰胺200mM）MEMNEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇Mm）PET（P104U/mS10μg/mlITSFnandN3：配制一20×不含DMEM/F12在15mlFALON释为1，ITSFn7.05m，N312.55m），0.2μm滤膜过滤，贮存0该入D2于4。液DE(糖)白50mg/ml胰岛素5mg/ml亚硒酸钠300μM黄体酮（20μM）腐胺100μM）PET（P10UmlS104μg/ml）层粘连蛋白100μg/ml纤维连接蛋白250μg/ml碱性rhFGF,10μg/ml*在第4步将bFF入N3使为10ng/ml。ITSFnandN3培养基贮存液的准备使用无菌的溶剂和稀释液在分装之前要对溶液进行过滤如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。贮存液，溶剂，贮存液，稀释剂和储存转铁蛋白50mg/ml胰岛素5mg/ml亚硒酸钠300μM黄体酮（20μM）腐胺100μM）PET（P10UmlS104μg/ml）层粘连蛋白（100μg/ml）纤维连接蛋白（250μg/ml）碱性rG,（10gml）包被有多聚鸟氨酸纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）包被液的准备多-L鸟氨酸15μg/ml把75ml多聚-L和425ml纤维结合蛋白1μg/ml把0.5ml纤维结合蛋白和500ml

1PBS混合。贮存在4℃。1PBS混合。包被过程：1．加入多聚-L-鸟氨酸，至少2～3小（夜行）2．吸多聚-L-鸟酸3．加纤结蛋，约1～2小时4．吸纤结蛋，置30干5．在4℃24孔板用200μl6孔板用500μl。震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需要剧烈震荡培养板。体外分化方法第1步：ES培养基在LIF（ESGR）存在的条件下维持细胞培养第2步：EB培养基使用细菌培养皿去除LF胚要4。1．细传）2．化2小后将胞入含有ES的50mlFalon，细胞量入15ml管中离心3分钟。3．用2mlEB养基悬细，吹至少10次成细悬液4．一个15cm的细菌养接种4～5106个细胞1个完全合组织培养通足接种4同规的菌养）。5．2天更养基将状转形中置3～5分使细胞沉。弃去上，将细胞悬于新鲜培养并接种在的细菌养皿中。6．用EB培养养第4天将胞入包的培皿这即1置1第3步。要4在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。这一天被认为是第2步和第3。第3：ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。3保持细胞在ISn中养约10天根据需要更换培养-大一。观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4第7天被入到第4第3步的第6第10。第4步：3培＋bFGF通将经体胞养有10ng/mlbFGF的培养基中进行扩增。1PBS洗涤加入2ml1×胰（1个15m培养所胰的根前表中的积（10×胰酶EDTA用PBS稀释）2．37℃孵育5钟3用B置3～5移。4有bFGF的N3。5细胞种包被聚-L-鸟氨酸/纤维接蛋的玻片（最将玻片放于24孔培养板或6孔培养板6培板中孔置5个盖片果塑料的置4，使最可的得品数）。24孔板接种3.515/孔或6孔板1.7×106/孔。6．2天更养基第5：N3培基通除bFGF使神经前体细胞分化1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3基2）3化10～5胞基PBS洗涤加入4%福尔马林室温放置30分钟PBS洗涤2次储存于PBS。长储使含0.01％氮的PBS四、移植细胞的准备细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm皿。移植1．将胚状体转移至一15ml圆锥形管中放置3～5分使胚体沉下来。细胞离心3钟会好放置之沉将会除多的个细（包死胞）而这细胞以被心下。2．去除清将状体悬于钙镁子的1×PBS中3．离心3分钟4．去除上清加入1×胰酶10cm加1ml）5．37℃水浴5钟6入B培养小吹约10次小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。7．离心2分钟8．吸出上清将细胞重悬于500μlEB基9打5次10．离心2次11．吸出上清将细重悬于100μlEB基烟酸己可碱标记S细胞进行移植1．准备一10μg/ml的烟酸已可碱染液（双苯酰亚胺，在冷冻室11）2．加入1mg（你能到最小）到5mlEB培养基（制成200μg/ml）3．将溶液稀释成10μg/ml100μl200μg/ml溶液和1.9mlB）4于2ml酸可碱液而是EB养备ES细液，5．将于（上）30分钟6．离心2分钟7．吸出上清将细胞重悬于2mlEB基8次9心2钟10．吸出上清将细重悬于100μlEB培基置于上。主要考献《细试指》胚胎干细胞培养操作规程维持E细胞处于未分化状态：E细胞培养用含有ES血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化为细胞提供包被有0明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每－天从达到8维持E细胞处于未分化状态：E细胞培养用含有ES血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化为细胞提供包被有0明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每－天从达到8％－90融合的平板按：的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板个小时使分化细胞粘附从而将分化和未分化细胞分开将细胞全程置于37℃5％C100％湿度条件下培养。培养基：E：配制一20×不含DM，H，ESG溶液（该溶液也能用于E培养基－－见下文）。分装在50mFAL，（稀释为2×，每管42m），贮存在20℃。通过将21m该溶液，H和ESG入450mlD备培养基，0.μ滤膜过滤。贮存于。注：一瓶DM500m。贮存液：DMEM糖）、马血清（H）、L谷氨酰胺（200m、MEA0m、HEPES）、β巯基乙醇（55Mm、PESTESGRO复苏细胞：细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMS中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞然而二甲基亚砜对细胞有毒性快速的进行细胞复苏是很重要的。操作步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15mlFalcon4．加入5mlS基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2mlS基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6c组织培养皿；8．孵育。冻存细胞冻存液：90H和10％二甲基亚砜步骤：1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；2．用细胞刮刀收集细胞；3．将细胞转入1