厌氧菌的药敏方法介绍课件

厌氧菌的药敏方法介绍（琼脂稀释法）熊德鑫北京100037一、受试菌的准备二、抗生素的稀释和准备三、培养基的准备四、抗生素的MIC试验五、结果观察厌氧菌的药敏方法介绍一、受试菌的准备1.将受试菌纯菌接种在厌氧菌血平皿上（一般使用GAM、BHI等），厌氧培养48h（厌氧手套箱中）,厌氧罐中72h。2.取一定量(3-5个菌落)混悬在不抑制厌氧菌生长的透明肉汤中如硫乙醇酸纳肉汤或布氏菌肉汤等。3.调节浓度到0.5号McFaland管中(相当于1.5×108CFu/ml),若用试管稀释法测MIC,则上述管应10倍稀释2次,终浓度为106CFu/ml即可使用,若为琼脂稀释法则不宜稀释,因为点种菌一般为1-3l,其浓度仍为1.5×105CFu/ml左右。4.也可将菌的混悬液经厌氧培养4-6h（生长缓慢菌应培养12h），这时应注意菌的浓度，如仍在0.5号MF管内就不作处理,超过此浓度宜作稀释后再使用。5.每次药敏试验受试菌中应注意加入标准菌株作为质控.①B.fragilis脆弱类杆菌(ATCC25285或NCTC9343)②B.thetaiotaomicron多形类杆菌(ATCC29741)③C.perfringens产气荚膜梭菌(AATCC13124)④E.lentum迟缓真杆菌(ATCC43055)6.琼脂稀释法中质控菌株MIC值(g/ml)允许范围（表1）表1质控菌株MIC允许范围(ug/ml青霉素u/ml) 抗生素*脆弱类杆菌*ATCC25285多形类杆菌*ATCC29741迟缓真杆菌*ATCC43055产气荚膜梭菌**ATCC13124羧苄青霉素（carbinicillin）

16-64

16-64

8-16

0.25-1头孢哌硐（cefoperazone）

32-64(128)32-128

32-128

0.125-0.5头孢氨噻肟（cefotaxime）

8-3216-64

64-256

0.6363-0.25氯霉素(chlorampheninol)2-8

4-16

NO

2-8

氯林可霉素（clindamycin）0.5-0.2

2-8

0.06-0.25

0.031-0.125甲哨唑（metronidazole）

0.25-10.5-2

0.5-2

0.125-0.5青霉素G（penicilling）

16-64(8-32)

16-64(8-32)

NO

0.063-0.25阿莫西林/棒酸（Amoxicillin/Clavulanicacid)

0.25-1

0.5-2

NO

0.25-1 抗生素脆弱类杆菌ATCC25285多形类杆菌ATCC29741迟缓真杆菌ATCC43055产气荚膜梭菌ATCC13124氨苄青霉素(Aminopenicillins)

16-64

16-64NO

NO氨苄西林/青霉烷砜(Aminopenicillih/sulbactam)(2:1)

0.5-2.0

5-2.0

2-4

0.25-2吡哌西林（piperacillin）

2-8

8-328-32

2-16吡哌西林/他唑巴坦（piperacillin/Tazobactan）

0.12-4

1.25-41-4

1.25-2替卡西林（Ticarcillin）16-64

16-64

16-64

0.5-1.0替卡西林/棒酸(Ticarcillin/Clavulanicacid)

NO0.5-2

16-64

1-4头孢美唑（cefmetazole）

16-64

8-32

8-32

2-16头孢西叮（cefoxitin）

4-16

8-32

4-16

2-8续表1质控菌株MIC充许范围(µg/ml青霉素u/ml) 抗生素脆弱类杆菌ATCC25285多形类杆菌ATCC29741迟缓真杆菌ATCC43055产气荚膜梭菌ATCC13124头孢替坦（cefotetan）

4-1632-128

32-128

2-4头孢唑肟（ceftizoxime）NO

4-1616-64

1.0-2.5头孢曲松（ceftriaxone）

32-128

64-256

NO2-4

头孢孟多（cefamandole）

32-12832-128

NO

0.025-1亚胺培南(Imipenen)

0.003-0.120.06-0.25

0.25-1.0

0.25-0.5拉氧头孢(latamoxef)

0.25-1

4-16

64-26560.5-8

美罗培南(melopenen)0.06-0.25

0.125-0.5

0.125-0.5

0.5-1.0续表1质控菌株MIC充许范围(µg/ml青霉素u/ml)*此表引自美国实验室标准化委员会(NCCLS)对厌氧菌药敏规定介绍1996.12**实用抗菌药物学第二版戴自英等主编上海科学出版社，1997二、抗生素的稀释和准备1.准确称取抗生素(我们一般称取2.56g,加DW或其它液体4ml)，以对倍稀释法稀释成系列浓度2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5。抗生素量的选择可据上表敏感范围作中点向上、向下各稀释5个浓度。2.用于稀释抗生素的常用液体的选择列于表2(其它未标明的抗生素均可用无菌水溶解)抗生素名稀释液配制保存氯霉素用少量无水乙醇溶解后加PH6.0磷酸盐缓冲液4℃长期保存红霉素用少量无水乙醇溶解后加PH6.0磷酸盐缓冲液-20℃3m,4℃2周林可霉素pH7.8磷酸盐缓冲液储存于-70℃冰箱中氯林可霉素pH7.8磷酸盐缓冲液溶化后立即使用青霉素GpH6.0磷酸盐缓冲液不再冻存四环素pH4.5磷酸盐缓冲液同上甲哨唑无菌蒸馏水微热或加0.1%吐温-80同上利福平先用少量甲醇溶解再加pH7.8磷酸盐缓冲液同上万古霉素无菌蒸馏水同上阿莫西林、替卡西林、棒酸磷酸盐缓冲液pH6.00.1mol/L同上氨苄青霉素、青霉烷磷酸盐缓冲液pH8.00.1mol/L同上头孢他坦无菌蒸馏水同上亚胺培南磷酸盐缓冲液pH6.00.1mol/L同上拉氧头孢2胺盐先用0.04mol/LHCL,再加pH6.10.1mol/L磷酸盐缓冲液静置1.5-2h使R.S异聚体各半其它头孢霉素磷酸盐缓冲液pH6.00.1mol/L

表2稀释抗生素常用液体3.一般宜选择表1中1-2种抗生素作为质控抗生素使用。4.抗生素稀释前最好换算成标准浓度单位,按化学纯品的活性度进行,并要除去非抗生素成份.三、培养基的准备1.使用布氏琼脂或GAM培养基

布氏琼脂(胰酪胨10g、动物组织蛋白酶消化物10g、酵母粉2g、葡萄糖1g、氯化纳5g、亚硫酸纳（NaHSO3)0.1g、0.5%氯化血红素1ml、1%vitk10.1ml、DW1000ml.pH7.0-7.2121℃15min高压灭菌。2.取上述稀释各浓度抗生素2ml至平皿中,再加入约50℃上述培养基18ml,倒平板时宜摇匀,这样抗生素浓度被稀释10倍,分别为:256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.253.试验时必需加入2块不加抗生素的平板,一块厌氧培养,一块做需氧对照。四、抗生素的MIC试验1.取上述准备好的受试菌液0.5ml，加入灭菌瓷板槽孔中,按顺序并作标记。2.用30-50点种针在上述各孔中沾取菌液,用手工或机械手点种到已准备好的抗生素平板面上(每点1l-3l)3.被点种平板做好标记并记录好顺序,同时点种两块不含抗生素平板，留一块作需氧对照,其余全部进入厌氧手套箱中,一般37℃厌氧培养48h。五、结果观察1.两块无抗生素平板，需氧平板无菌生长,而厌氧平板受试菌株全部生长。2.标准菌株及已知抗生素平板上生长在表1范围内说明本次试验符合要求。3.从抗生素高浓度平板向低浓度观察生长情况,未生长浓度(一般连续3个浓度)为此受试菌株的MIC,现在一般以mg/L(或µg/ml)表示。4.从上述未生长MIC处向上和向下各取一个浓度(包括未生长MIC点)，用接种环在菌原接种点上涂抹后再接种至布氏或GAM血平板上,无菌生长点为MBC。5.同一种受试菌10株以上MIC值统计学处理求MIC50、MIC90。6.药物敏感的判断列于表3中。表3MIC法解释标准（琼脂稀释法）抗生素MIC(µg/ml或mg/L)敏感中介耐药阿莫西林/克拉维酸≤2～44～8≥8～16氨苄青霉素≤2(b)4(b)≥8(b)氨苄西林/青霉烷砜≤4～88～16≥16～32羧苄青霉素≤64128≥256青霉素G≤2(b)4(b)≥8(b)吡哌西林≤3264128吡哌西林/他唑巴坦≤4～324～64≥4～128替卡西林≤

3264≥128替卡西林/克拉维酸≤2～324～64≥2～128续表3MIC法解释标准（琼脂稀释法）抗生素MIC(µg/ml或mg/L)敏感中介耐药头孢美唑≤

1632≥64头孢西叮≤1632≥64头孢哌酮≤1632≥64头孢噻肟≤1632≥64头孢替坦≤1632≥64头孢唑肟≤32（c）64（c）≥128（c）头孢曲松≤1632≥64头孢孟多≤816≥32亚胺培南≤48≥16续表3MIC法解释标准（琼脂稀释法）抗生素MIC(µg/ml或mg/L)敏感中介耐药抗氧头孢≤16（d）32（d）≥64（d）氯霉素≤816≥32氯林可霉素≤24≥8四环素≤48≥16甲哨唑≤816≥32注:A.血液中药物水平可以相当高，所以，不产生β-内酰胺酶菌株感染，MIC值低时疗效好。B.只适用于琼脂稀释法，若为肉汤稀释法，判定值要低一级（≤16，32，≥64）。C.若每日药量为4g时，判定值可低一级。关检厌氧菌药敏的K-B（纸片法）说明：厌氧菌的药敏试验一般不宜使用K-B法做敏感试验，提倡使用试管或琼脂稀释法做药敏，有时为了临床需要也做K-B法,提供临床参考。方法1.纸片的制备：选用国产新华Ⅰ号滤纸，使用打孔机制备成为6mm纸片。2.纸片干热灭菌（120℃）2h灭菌。3.按表4配好各种抗生素浓度。表4纸片法各种抗生素配制及判定标准（引自国内1993发表资料综合）抗生素抑菌环直径（mm）每片含药量（mg）耐药中介敏感氯霉素3017～2723～29>29氯林可霉素2<1010～14>14红霉素10<1516～21≥22林可霉素15210<18<15<919～266～1510～24≥27≥16≥25青霉素G10u≤1213～26≥2-7四环素30≤1718～29≥30万古霉素30≤1415～20≥20羧苄青霉素100≤1213～22≥23头孢菌素30≤1011～22≥23强力霉素30≤1213～24≥25甲硝唑5≤88～21≥