土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(上课)

课题2土壤中分解(fēnjiě)尿素的细菌的分离与计数专题(zhuāntí)2微生物的培养与应用第一页，共五十一页。编辑课件一、课题(kètí)背景1、尿素(niàosù)的利用尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能(cáinéng)被植物利用。2、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+H2O+CO2NH3第二页，共五十一页。编辑课件3、常见(chánɡjiàn)的分解尿素的微生物芽孢(yábāo)杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌。4、课题(kètí)目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一.研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照第三页，共五十一页。编辑课件1、实例(shílì)：启示(qǐshì)：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉(rèquán)温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。DNA多聚酶链式反应是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。第四页，共五十一页。编辑课件要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：⑴抑制大多数微生物不能生长⑵造成有利于该菌生长的环境结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板(píngbǎn)稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选(shāixuǎn)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括(bāokuò)营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。第五页，共五十一页。编辑课件15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的细菌(xìjūn)的分离与计数所需培养基：①从物理性质(wùlǐxìngzhì)看此培养基属于哪类？固体(gùtǐ)培养基第六页，共五十一页。编辑课件②在此培养基中哪些(nǎxiē)作为碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素(niàosù)氮源：尿素(niàosù)〖思考2〗该培养基对微生物

（具有，不具有）选择作用。如果(rúguǒ)具有，其选择机制是

。具有只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长第七页，共五十一页。编辑课件

培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制(yìzhì)，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、培养基选择分解尿素(niàosù)的微生物的原理第八页，共五十一页。编辑课件1、显微镜直接(zhíjiē)计数：利用血球计数板，在显微镜下计算(jìsuàn)一定容积里样品中微生物的数量。（二）.统计菌落(jūnluò)数目：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点第九页，共五十一页。编辑课件（比例(bǐlì)计数法）待测样品(yàngpǐn)等量(děnɡliànɡ)的已知含量的红细胞混匀涂抹测定：红细胞数目细菌数目计算单位体积内的细菌数目将含已知数目的红细胞液体与待测的菌液按1：1均匀混合，在显微镜下数出各自的数目，然后求菌液中的细胞数目。细菌红细胞【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。第十页，共五十一页。编辑课件举例：已知红细胞浓度(nóngdù)为M个/mL，从体积为NmL的大肠杆菌培养液中取出大杆菌液与红细胞液等量均匀混合后，涂片，染色，镜检。在同一视野中发出有红细胞W个，大肠杆菌Y个，求NmL大肠杆培养液中大肠杆菌的个数X是多少？X＝N×M×YW(个)观察(guānchá)到的红细胞平均数/观察(guānchá)到的细菌平均数＝红细胞含量/细菌含量公式第十一页，共五十一页。编辑课件2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落(jūnluò)是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落(jūnluò)代表原先的一个单细胞。

⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表(dàibiǎo)某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表(dàibiǎo)涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表(dàibiǎo)稀释倍数。第十二页，共五十一页。编辑课件注意事项①为了保证(bǎozhèng)结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。④恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。第十三页，共五十一页。编辑课件如何从平板上的菌落数推测(tuīcè)出每克样品中的菌落数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好(zuìhǎo)能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算教材(jiàocái)P22第十四页，共五十一页。编辑课件计数法直接(zhíjiē)计数法、平板计数法、比浊法、膜过滤法第十五页，共五十一页。编辑课件实例(shílì)分析P22你认为哪个同学的结果更接近真实值？你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果(rúguǒ)需要，如何改进？第十六页，共五十一页。编辑课件实例(shílì)分析P22第一同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有(jùyǒu)说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了三个平板，但是其中1个平板的计数结果与2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。第十七页，共五十一页。编辑课件设置对照的主要目的是排除实验组中非测试(cèshì)因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。（三）.设置(shèzhì)对照：实例(shílì)：教材P23原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)第十八页，共五十一页。编辑课件小结：通过这个事例可以(kěyǐ)看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案(fāngàn)一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行(jìnxíng)培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。第十九页，共五十一页。编辑课件菌落计数配制土壤溶液系列稀释涂布平板与培养根据图示2－7填写以下(yǐxià)实验流程：试验(shìyàn)设计：第二十页，共五十一页。编辑课件实验的具体操作

㈠.土壤取样

从肥沃(féiwò)、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。第二十一页，共五十一页。编辑课件准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择(xuǎnzé)培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。第二十二页，共五十一页。编辑课件◆应在火焰(huǒyàn)旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行◆分离不同的微生物采用不同的稀释(xīshì)度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板[三]样品(yàngpǐn)的稀释第二十三页，共五十一页。编辑课件由于初次(chūcì)实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。第二十四页，共五十一页。编辑课件

为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤(tǔrǎng)中细菌的总量和测定土壤(tǔrǎng)中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择(xuǎnzé)培养的条件。第二十五页，共五十一页。编辑课件㈣.取样(qǔyàng)涂布◆实验时要对培养(péiyǎng)皿作好标记。注明培养(péiyǎng)基类型、培养(péiyǎng)时间、稀释度、培养(péiyǎng)物等。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数(bèishù)的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。第二十六页，共五十一页。编辑课件㈤.微生物的培养与观察(guānchá)并计数在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足(bùzú)而导致遗漏菌落的数目。培养(péiyǎng)不同微生物往往需要不同培养(péiyǎng)温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。第二十七页，共五十一页。编辑课件当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板(píngbǎn)进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板(píngbǎn)进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板(píngbǎn)所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

第二十八页，共五十一页。编辑课件微生物的培养(péiyǎng)与观察第二十九页，共五十一页。编辑课件第三十页，共五十一页。编辑课件关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌(xìjūn)的重要手段。第三十一页，共五十一页。编辑课件关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分(qūfēn)细菌的重要手段。第三十二页，共五十一页。编辑课件关注(guānzhù)菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。第三十三页，共五十一页。编辑课件关注(guānzhù)菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。第三十四页，共五十一页。编辑课件关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色(yánsè)、质地等等，都是区分细菌的重要手段。第三十五页，共五十一页。编辑课件〖思考〗在研究未知微生物时务必规范(guīfàn)操作，以防被致病微生物感染，实验后一定要洗手。第三十六页，共五十一页。编辑课件（六）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存1、酚红培养基：

鉴定分解(fēnjiě)尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性2、伊红—美蓝培养基：

鉴定大肠杆菌。原理：代谢产物与伊红—美蓝结合→菌落呈深紫色并带有金属光泽。第三十七页，共五十一页。编辑课件

伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以(kěyǐ)用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。例如：鉴别(jiànbié)大肠杆菌培养基第三十八页，共五十一页。编辑课件大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)呈黑色中心,有或无金属光泽大肠杆菌(dàchánɡɡǎnjūn)在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

第三十九页，共五十一页。编辑课件三、操作(cāozuò)提示

无菌操作(cāozuò)

做好标记(biāojì)

制定计划

第四十页，共五十一页。编辑课件课题成果(chéngguǒ)与评价

（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择(xuǎnzé)培养基是否筛选出菌落

对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选(shāixuǎn)出一些菌落。第四十一页，共五十一页。编辑课件如果学生选取的是同一种土样，统计的结果(jiēguǒ)应该接近。如果结果(jiēguǒ)相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。（二）样品的稀释操作是否(shìfǒu)成功如果得到了2个或2个以上(yǐshàng)菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。

（三）重复组的结果是否一致第四十二页，共五十一页。编辑课件本课题(kètí)知识小结:第四十三页，共五十一页。编辑课件课后练习

2.提示：反刍动物(fǎnchúdònɡwù)的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。第四十四页，共五十一页。编辑课件六、例题(lìtí)解析

例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A．在液体培养基上进行B．至少接种一种(yīzhǒnɡ)细菌C．接种一个细菌D．及时补充消耗的营养物质解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争(dòuzhēng)而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。答案：A第四十五页，共五十一页。编辑课件1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.在液体培养基上进行B.至少(zhìshǎo)接种一种细菌C.接种一个细菌D.及时补充消耗的营养物质2.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌B.培养真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素实践(shíjiàn)训练A

CD第四十六页，共五十一页。编辑课件4.下列说法不正确(zhèngquè)的是（）A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.较多的氮源物质B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物D.高浓度食盐BC第四十七页，共五十一页。编辑课件（09，宁夏，15分）（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑______、______和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、______、______等优点，因此常作为(zuòwéi)遗传学研究的实验材料。（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行________（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和______；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能__________。（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的_______。（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的____________。（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_________。（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_______处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。答案:（1）温度酸碱度易培养生活周期短

（2）灭菌消毒损伤DNA的结构（3）比例合适

（4）鉴定(或分类)（5）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察(guānchá)培养基上是否有菌落产生.