实验一光合细菌的培育

关于实验一光合细菌的培育第1页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三一、实验目的：通过本实验，了解并掌握光合细菌的培养方法。第2页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三二、实验仪器设备：光和细菌的培养设备：包括灭菌设备、培养容器、培养用具和检测仪器。1.灭菌设备：高压蒸汽灭菌锅，用于高压湿热灭菌。2、培养容器(1)试管：φ15mm×L160mm(中型试管)。主要用于液体培养和斜面培养。

φ20mm×L180mm(大型试管)。主要用于制平板深层试管或盛无菌水等。(2)培养皿：

φ6～10cm(常用φ9cm).用于制作平板培养基，以分离菌种和观察菌落形态。(3)移液管：容量1～10ml(常用1ml、5ml、10ml)，制备培养基、稀释液体、吸取样品等使用。第3页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三(4)锥形瓶(有、无具塞磨口两种)：30～500ml。用于各种光和细菌单体或组合连续培养的逐级扩大培养用。(5)三角烧瓶：500～5000ml，用于扩大培养。(6)细口瓶：5000～20000ml，用于扩大培养和生产性大量培养。(7)塑料薄膜袋：用于生产性大量培养。(8)大型塑料水槽：一般为圆柱形。容量为300～500L，用于生产性大量培养。第4页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三3、培养用具(1)操净工作台：用于菌种的分离和接种。(2)恒温培养箱（或人工气候箱，光照培养箱）：主要用于培养菌种和小型培养使用。箱内必须带有钨丝灯泡的人工光源。(3)电冰箱和冷藏冰柜：主要用于菌种和某些有机试剂的保存以及光和细菌母菌种液的长期保存(5-10)℃。(4)接种环：用于菌种取样、接种。(5)电动离心机：用于液体菌种浓缩和采收。第5页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三(6)空压机：用于微气方式培养。(7)电风扇和排气风扇：用于培养时控温、调稳。(8)分析天平：用于试验产品烘干后的称重及分析称样等。(9）此外，应还有分液漏斗、载波片、盖玻片、酒精灯及电光源(碘钨灯、白炽灯泡等)设施及其支架、控温设备和充气设备。

第6页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三三、实验内容：1.光和细菌培养基的制备2.光合细菌菌种的分离3.菌种的培养4.菌种的保存5.光和细菌的大量培养6.光合细菌的培养技术和保种技术。第7页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三四、实验步骤与方法：（一）光和细菌培养基的制备Sawad培养基(1975)：用于单菌落分离和荚膜红假单孢菌的培养。

第8页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三1.微量金属元素(T.m.)贮液培方EDTA2.5gZnSO4·7H2O10.95gMgSO4·H2O1.54gCuSO4·5H2O0.39gCoCl2·6H2O0.2gFeSO4·7H2O7.0g蒸馏水1000ml第9页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三2.生长素贮液培方：生物素1mg烟酸(尼克酸)0.1mg对氨基苯甲酸10mg维生素B1100mg蒸馏水1000ml。酵母膏和生长素贮液二者有一即可(即：有了酵母膏就不必加生长素)。第10页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三（二）光合细菌菌种的分离培养光和细菌，首先要有菌种，菌种可以从别的单位获得。如果别的单位没有适合的菌种，就要从自然生态环境中分离。分离菌种的工作要求虽然比较高，但也并非高不可攀，只要按照要求操作，就能分离出需要的菌种。第11页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三1.采样

要根据光和细菌的生态特点，选择光和细菌大量分布的地方采样。目前，水产养殖业使用的光和细菌，主要是红螺菌科的一些种类。这些光和细菌是以有机质作为光和细菌的碳源和供氢体，故广泛分布在被有机质污染的地方，如河底、湖底、海底、水田、沟渠和污水池塘的泥土以及豆制品厂、淀粉厂和食品工业等废水排水沟处呈橙黄色或分红色的泥土中。

第12页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三光和细菌在污水池塘等有机质含量丰富的地方，分布数量更大。在以上所述地方都可以采集样品。采样工具有杯、采水器和采泥器，浅水处直接用杯舀取少量样品，深水处借用采水器和采泥器采样，采集到的底泥连同水一起放入广口瓶中带回。第13页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三2.富集培养采集的样品中光和细菌的数量一般较少，并且含有不少杂菌，难以直接进行分离，必须进行富集培养。所谓富集培养，就是为要分离的光和细菌提供适宜的培养基与培养条件，使其大量增殖。同时抑制杂菌的生长。第14页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三

富集培养除了培养基以外，还要给培养物制造缺氧的培养环境。为此，先将采回的样品(泥土或水)装入玻璃圆筒或大型试管或具塞的磨口玻璃瓶中，再倒入预先配制好的液体培养基，充分搅拌，使样品与培养基充分分散混合，然后在玻璃圆筒或大型试管中加入液体石蜡，以完全隔绝空气，防止空气中的氧气溶解于培养基中（图1，a）。光和细菌的富集培养法

a.玻璃圆筒富集培养法b.具塞磨口玻璃瓶富集培养法

1.液体石蜡2.橡皮圈3.塑料布第15页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三如果用具塞的磨口瓶，则要加满培养液，盖上瓶塞，让多余的培养液总瓶口溢出，瓶内不能有气泡存在。瓶口套上塑料薄膜，用橡皮筋扎以减少水分蒸发（图1，b）。第16页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三为了加快光和细菌的增殖，除了缺氧的环境条件以外，适宜的温度和光照度也很重要。培养温度一般为25～30℃，光照强度为5000～10000lx，最好一天24h连续光照，经过2～6周的富集培养，在培养容器的内壁逐渐出现光和细菌菌落，或整个培养液长成红色。一般地说，海水光和细菌比淡水光和细菌生长缓慢，故富集培养的时间更长。第17页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三如果富集培养初步获得成功，就用吸管或移液管插入菌液中或光和细菌大量繁殖的泥层中，将菌液吸入大型试管或具塞磨口瓶中，加入培养基，按前述的方法和条件继续培养。反复多次后，光和细菌压倒其他细菌而占绝对优势，培养液呈深红色，这时富集培养成功。第18页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三（3）分离方法一旦富集培养成功，就可以分离培养。淡水生长的紫色非硫细菌生长速度较快，在一周左右移植比较合适，而海水生长的紫色非硫细菌生长速度较慢，培养三周以上才能移植。菌种的分离一般采用平板分离法。平板分离法是使待分离的菌种以单个细胞在平板培养基上分散开，形成一个个菌落，从而达到分离的目的。第19页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三红螺菌属的分离方法:利用红螺菌属细菌具有快速运动的能力来分离这种细菌的方法。在载波片上加一滴无菌水，再在它的近旁加一滴紫色非硫细菌的富集培养液，无菌水旁加一滴培养液，当培养液与无菌水滴结合时，红螺菌较其他微生物更快地达到培养液的部位，用微吸管吸出到液体培养基中培养，这样反复移植几次后，就能在琼脂斜面或平板上分离取得红螺菌的菌落，并进一步分离而取得纯培养物。第20页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三4.菌种的培养(1)培养方式大量培养光和细菌，通常采用两种方式进行培养。一种是全封闭式厌气光照培养方式，另一种是开放式微气光照培养方式。第21页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三(1)全封闭式厌气光照培养全封闭式厌气光照培养是采用无色透明的玻璃容器或塑料薄膜袋，经消毒后，装入消毒好的培养液接入20%～50%的菌种母液，使整个容器均被液体充满，加盖（或扎紧袋口），造成厌气的培养环境，置于有阳光的地方或人工光源进行培养，定时搅动，在适宜的温度下，因经过5～10天的培养，即可达到指数生长期高峰，此时可采收或进一步扩大培养。第22页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三(2)开放式微气光照培养开放式微气光照培养，一般采用容量为100～200L的塑料桶或500L的卤虫孵化桶为培养容器。底部成锥形并有排放开关的卤虫孵化桶比较理想。在桶底部装一气石，培养时微充气，是桶内的光和细菌呈上下缓慢翻动。在桶的正上方距桶面30cm左右装一有罩的白炽灯泡，使液面照度达2000lx左右。培养前把容器消毒，加入消毒好的培养液，接入20%～50%的菌种母液，照明，微气培养。在适宜的温度下，因经过7～10d的培养，即可达到指数生长期高峰，此时可采收或进一步扩大培养。第23页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三(2)培养方法光和细菌的培养，按次序分为容器、工具的消毒，培养基的制备，接种和培养管理四个步骤(1)容器、工具的消毒所有培养用容器(如试管、三角烧瓶等)、工具(如移液管、分液漏斗等)都必须在用前用去污粉、洗液、或肥皂粉等刷洗并冲洗干净，如果玻璃瓶壁上有白色菌膜或碳酸容器、工具洗刷干净后，用以下几种方法进行消毒灭菌:第24页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三1)加热消毒法A直接烧灼消毒B煮沸消毒C高温烘箱干燥消毒(干热灭菌)D高压蒸汽消毒(湿热灭菌)E化学药品消毒法a.酒精(C2H5OH)：b.高锰酸钾(KMnO4)：c.石炭酸(酚C6H6OH)：d.盐酸(HCl)：第25页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三2)培养基的配制3)灭菌和消毒

(3)接种培养基配好后(培养基需冷却的要冷却到适宜的温度，应立即进行接种。开始时由于菌种数量少，先在试管中培养，然后再逐渐往大培养容器接种。随着菌种数量增加，可以加大接种量，掌握在20%～50%，即菌种母液量和新配培养液量之比为1:4(20%)～1:1(50%)，尤其是微气培养，接种量不应低于1:4(20%)。(4)培养管理第26页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三光和细菌的培养过程中，管理工作包括：

A.日常管理操作和测试；

B.生长情况的观察和检查；

C.出现问题的分析处理。第27页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三1)日常管理操作和测试a.搅拌和充气b.调节光照度c.调节温度：2)生长情况的观察和检查3)问题的分析和处理第28页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三3)问题的分析和处理通过日常管理、检测、检查，了解光和细菌的生长情况，就可以结合当时的环境条件的变化进行分析，找出影响光和细菌生长繁殖的原因，采取相应的措施。第29页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三影响光和细菌生长的原因很多：内因：菌种是否优良。外因：光照、温度、pH值、营养、敌害、厌气程度等。光照、温度、pH值同时影响着光和细菌的生长，而且光照、温度、pH值之间是互相制约的，即温度高，光照应弱；温度低，光照应强。如果温度高，光照强，pH值就会迅速升高，培养基产生沉淀，抑制光和细菌的生长。如果温度低，光照弱，光和细菌得不到最佳能源，生长速度也慢。经试验得出光和细菌生长的最适条件是：①温度15～20℃时，光照30000～50000lx，培养基pH值为7.0；②温度25～30℃时，光照为3000～5000lx，培养基pH值为7.0。第30页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三光和细菌培养过程中的问题分析例1出现问题：测定pH值无大变化，O.D.值不上升，生长受阻。检查结果：水温42℃，其余条件正常。分析原因：温度超出生长适应范围。第31页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三例2出现问题：测定O.D.值，升高较慢，光和细菌生长繁殖不快。检查结果：磁力搅拌棒偏于边缘，不起搅拌作用，其余条件正常。分析原因：菌液无搅拌，影响光和细菌的生长。第32页，讲稿共38页，2023年5月2日，星期三例3出现问题：测定pH值和O.D.值均不上升，发生附壁现象。检查结果：环境条件正常，培养措施得当。分析原因：