第三章载体全章DHY版黑白版

第三章载体全章DHY版黑白版一、载体的概念

要把一个有用的外源基因通过基因工程手段送进生物细胞中，需要运载工具。这种能与目的基因结合，携带外源基因进入受体细胞,且有完整的复制和转录功能的DNA大分子叫载体（Vector）。

第一节质粒载体质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA）DNA分子。一、质粒的一般特性(一)质粒的分布及数量质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞（酵母的2μ环状质粒）。一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。这取决于质粒的复制类型。(二)质粒DNA的构型三种不同的构型：SC构型（图c)：超螺旋形态存在的共价闭合环形DNA(cccDNA)OC构型)(图b)：开环DNA(ocDNA)L构型(图a):线形DNA分子(三)质粒DNA的生物学特性(1)寄生性：(2)稳定性：(3)同源性：(4)重组性：

(5)不相容性：(6)传递性：(7)复制类型：(8)表现型：(四)质粒的命名原则1976年提出pUC18plasmidUniversityofCalifornia编号二、构建理想质粒载体必须具备的条件(一)理想质粒拷贝数较高(二)理想质粒分子量较小(五)理想质粒带有可供选择的标记(三)带有尽可能多的单一限制性酶切位点(四)具有复制起始点(ori)lacZ-β-半乳糖苷酶-分解半乳糖iPO调控蛋白Pα-肽段分解X-gal产物呈现蓝色诱导剂IPTG常采用的标记是对某种抗生素的抗性β-半乳糖苷酶筛选系统（α-互补或蓝白斑筛选）。质粒三、常用的质粒载体“天然质粒”：pSC101。pSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA的大肠杆菌天然质粒载体。pSC101缺点：(一）克隆载体1、pBR322质粒载体2、pUC质粒载体3、pGEM质粒载体pGEM系列与pUC系列之间的主要差别pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：BL21（DE3）。4、TA克隆载体

TaqDNA聚合酶可以在PCR产物的3’端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷（A）。根据这一特点研制出了一种线性质粒，其5’端各带一个不配对的脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的载体称为TA克隆载体。5、酵母中的2μm环质粒酵母游离质粒（yeastepisomalplasmids,YEps）酵母整合质粒（）酵母复制质粒（YRps）：穿梭质粒（shuttleplasmid）pDB219

(二)表达载体基因表达(geneexpression)基因经过转录、翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。DNA转录RNA翻译蛋白质逆转录pKK表达质粒载体

pGEX融合表达载体系统QIAexpresspQE(6×His)表达系统一、噬菌体载体Bacteriophage(phage)；phagos

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，个体微小；不具有完整细胞结构；只含有单一核酸。

第二节其它载体1、噬菌体的生物学特性①对寄主功能的依赖性②保护自己的核酸分子免遭环境化学物质的的破坏③将核酸分子注入到被感染的细菌细胞④产生大量的子代噬菌体颗粒⑤使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒2、噬菌体的结构及其核酸类型结构类型无尾部的二十面体型有尾部的二十面体型线状体型核酸类型双链线性DNA双链环形DNA单链环形DNA单链线性DNA单链RNA3、噬菌机理噬菌斑(plaque)溶原性噬菌体溶原性细菌原噬菌体(prophage)二、λ噬菌体克隆载体1、λDNA

cos位点（cohesiveendsite）TACGGGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGA环化作用

除了两个正调节基因N和Q之外，其余的是按功能的相近性聚集成簇的。例如，头部、尾部、复制及重组四大功能的基因.

2、λ噬菌体的缺陷与改造

λ噬菌体的改造λ噬菌体的缺陷：3、λ噬菌体作为构建克隆载体材料的依据

①λ噬菌体是一种温和噬菌体②能承载比较大的外源DNA片段。③多种限制性核酸内切酶识别位点4、构建λ噬菌体克隆载体的基本策略①减少或增加酶切位点：②非必需区部分切除③可供选择的标记④体外包装5、λ噬菌体克隆载体的主要类型两种类型：置换型载体：插入型载体：6、λ重组体DNA的体外包装1）相关概念转染（Transfection）：重组噬菌体的体外包装：

λ噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。某种生物的一系列cDNA分子先通过置换或插入的方法与合适的λ噬菌体克隆载体重组，然后或者经体外包装成噬菌体颗粒后转导受体菌细胞，或者不经体外包装直接转染受体菌细胞。7、λ噬菌体克隆载体的应用

丝状外壳包装蛋白和正链DNA组成

分泌型6407个核苷酸至少有11个基因2700个外壳蛋白分子三、M13噬菌体载体M13噬菌体的基因组四、柯斯（cosmid）克隆载体1978年Collins和Hohn构建“cossite－carryingplasmid”缩写而成的人工构建柯斯质粒（cosmid）=cos序列+质粒实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同λ噬菌体的cos位点构成。

pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI四、噬菌粒载体（phagemidvectors）

噬菌粒（phagemid）实际上是带有丝状噬菌体大间隔区的质粒载体，是集质粒和丝状噬菌体的有利特征于一身的载体，六、

人工染色体克隆载体

人工染色体指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。酵母人工染色体酵母人工染色体（YAC)是人工染色体中能克隆最大DNA片段的载体，可以插入100-2000kb的外源DNA片段。