冰片促丹参素到达兔眼内能力的实验研究

冰片促丹参素到达兔眼内能力的实验研究冰片的作用冰片具有通诸窍,散郁火,去翳明目,消肿止痛之功能。冰片较少单独应用,常作为“引药”,以增加其它药物的治疗效果,即中医所谓的“芳香走窜,引药上行”“独行则势弱,佐使则有功”。血眼屏障血视网膜屏障血房水屏障血视神经屏障其结构和功能与BBB相似，这些屏障有一个共同的特点，就是血管内的小分子物质可以通过，而血液中的成分和大分子物质则不能通过血管壁而到达房水或视网膜内。

这些屏障的的存在，也同时限制了许多治疗性药物的通透性，在组织内达不到治疗浓度，限制了某些药物的治疗作用，如果加大药物的剂量势必会使药物的副作用加大.丹参素具有改善微循环和抗自由基的作用材料与方法动物与试剂

110健康家兔,体重2.2-2.5kg，由哈尔滨医科大学中心实验室提供,温度(22±3)℃、湿度(65±5)%丹参素标准品购于中国药品检验检定所冰片购于北京同仁堂药店高效液相色谱仪:HP1100LC-2010A,AgilentCo.,USA将实验动物分为两组：丹参素组和丹参+冰片组每组再分为11组(血浆组,5,15,25,35,45,60,120,270,600and900分钟组)

实验组（冰片+丹参）血浆亚组：给予冰片（溶于95%乙醇稀释成40mg/100ml）口服灌胃15分钟后，给予中药丹参冻干粉（）+0.85%生理盐水20ml右耳缘静脉推注。实验组的血浆亚组每只动物在丹参给药后0、5、10、20、30、45、60、90、120min于家兔左耳缘静脉采血1.5ml。眼内亚组在给药后5、15、25、35、45、60、120、270、600、900min处死动物，用0.85%生理盐水快速充分冲洗结膜囊，然后用1ml注射器在角膜缘内1ml刺入前房抽取房水（每次更换注射器）。冷藏，12h内送检。检测房水和玻璃体内丹参的水溶性标志成分丹参素（Dhpl）的含量。对照组给予与实验组对应剂量95%乙醇口服灌胃15分钟后给予中药丹参冻干粉（）+0.85%生理盐水20ml右耳缘静脉推注。其他实验方法与实验组相同。供试品溶液的制备上述方法得到的全血，以3000转/min离心10min，取血浆取血浆样品0.2ml，加1%醋酸0.08ml，1mol/L盐酸0.08ml，混匀，加乙酸乙酯2ml，漩涡混合提取2min，离心(10000r/min)5min。分取有机层1.5ml，45℃水浴上通空气流挥干。临用前残渣用1ml流动相溶解，超声震荡20min，漩涡混合2min，离心(12000r/min)10min，取上清液备用。房水同血浆。色谱条件色谱柱THERMO(日电)，HypersilBDSC18，(5μm4.6mm×250mm);预柱:

自填国产YWGC18；流动相为乙腈：0.01㏖/L磷酸二氢钾（8：92）用磷酸缓冲液调；紫外检测波长279nm；流速；柱温为室温。标准曲线的制备配制标准工作液

精密称取丹参素对照品适量，加1%醋酸配成浓度为1mg/ml的贮备液，4℃保存。临用前，取丹参素贮备液适量，用1%醋酸溶液按倍数稀释法稀释至所需浓度，即得丹参素的标准工作液。标准曲线的制备

兔血浆标准曲线的制备

兔房水标准曲线的制备

兔玻璃体标准曲线的制备线性关系（1）血浆线性关系按“标准曲线的制备”方法测得丹参素的峰面积(Yd)与丹参素血浆浓度(Xd)在～1000μg/ml范围内线性关系良好，，γ=0.9999。结果见图1。图1丹参素的血浆标准曲线Figure1Standardcurveofdanshensu(Dhpl)inplasma房水线性关系按“标准曲线的制备”方法测得丹参素的峰面积(Yd)与丹参素房水浓度(Xd)在～50μg/ml范围内线性关系良好，，。结果见图2。图2丹参素的房水标准曲线Figure2Standardcurveofdanshensu(Dhpl)inaqueous玻璃体线性关系

测得丹参素的峰面积(Yd)与丹参素房水浓度(Xd)在0.0781-2.5μg/ml范围内线性关系良好，，。样品测定方法（1）血浆：精密吸取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录丹参素的峰面积，以丹参素峰面积为定量指标，根据标准曲线求算相应的血药浓度。（2）房水、玻璃体：精密吸取供试品溶液100μl注入液相色谱仪，记录丹参素的峰面积，以丹参素峰面积为定量指标，根据标准曲线求算相应的房水和玻璃体药浓度。结果兔空白血浆加入标准品色谱图给药120min后兔血浆色谱图给药25min后兔房水色谱图血浆内Dhpl的测定时间n对照组实验组t检验

不同时间点对照组、实验组房水Dhpl浓度(μg/ml)时间n对照组实验组t检验

600min00900min00不同时间点对照组、实验组玻璃体Dhpl浓度(μg/ml)时间n对照组实验组t检验

5min100.2014±0.04750.5977±0.0874p＜15min100.4564±0.08460.7345±0.0718p＜25min100.7503±0.11601.132±0.1786p＜35min100.5067±0.10180.7345±0.0993p＜45min100.5722±0.08760.8080±0.1104p＜60min100.4818±0.10190.7147±0.1178p＜120min100.6022±0.11470.8544±0.1277p＜270min100.3495±0.08020.4309±0.0928p＜600min100.1720±0.05340.2200±0.0571p＜900min100.0979±0.02020.1188±0.0305p＜0.05结论我国传统医药历史悠久，几千年来，人们就一直应用中草药治疗各种疾病，随着医学进展，中西医结合的方法在眼科临床治疗中收到了良好的效果。丹参始载于《神农本草经》,被列为上品,历代本草均有收载。具祛瘀止痛,活血通经,清心除烦之功效。是现代临床常用的活血化瘀药物,在眼科用于视网膜动、静脉阻塞、眼底出血、视神经病变等方面具有较好作用。研究表明,丹参的水溶性成分主要为酚性芳香酸类化合物,多含有苯丙烷结构,以及该类酸缩合形成的多酚芳酸，主要有丹参酸甲(丹参素)、丹参酸乙、丹参酸丙、原二茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C和迷迭香酸等。中华人民共和国药典明确写明丹参素是丹参水溶性成分中的主要药效成分，既丹参的标志性成分。又因实验注射所用丹参冻干粉为复方丹参水溶性制剂，故本研究中把丹参素(Dhpl)作为示踪目标从而观察丹参是科学的。考察了以下流动相对给药后血浆样品测定的影响，流动相A:甲醇—水—冰醋酸(17∶82∶1);流动相B:乙腈—0.01mol·L-1磷酸二氢钾溶液(8∶92)(磷酸调至pH2.8);流动相C:乙腈—水—冰醋酸(9∶90∶1)。结果表明,只有流动相B使丹参素达到了基线分离,且极性较小的酚酸类成分基本不干扰样品中丹参素的测定。由于丹参素为酸性化合物,因此考察了不同酸度流动相(pH2.8,3.8及4.8)对分离的影响。结果表明,当pH2.8时,由于离解被抑制,丹参素分离较好,色谱峰的对称性明显改善。本实验采用液-液萃取法，考察了萃取溶剂(乙酸乙酯)用量及酸度对萃取的影响。结果表明,于血浆、房水0.2mL中加入1mol·L-1盐酸0.08mL,将pH调至1.5,用乙酸乙酯2mL萃取,于玻璃体0.5mL中加入1mol·L-1盐酸0.2mL,用乙酸乙酯5mL萃取，丹参素可被较好地萃取。丹参素高、中、低3种浓度的平均萃取回收率均在75%以上，且又经过组分的分离及浓集等处理过程，去除了干扰测定的杂质，并使被测组分浓集。此方法可靠，结果稳定，符合生物样品测定要求。血-房水屏障由睫状体无色素上皮的紧密连接、虹膜组织的连接和虹膜血管组成，就像一张有微孔半径105µm的半透性膜。血-房水屏障的存在使房水与血液的成分及其质量浓度不同，药物能否到达房水取决于其能否通过血—房水屏障。血-视网膜屏障是视网膜血管内皮、视网膜色素上皮间、睫状体无色素上皮间的紧密连接复合体。丹参素在玻璃体内的吸收情况未见报道。本实验结果表明，中药复方丹参静脉注射后能够通过血-眼屏障到达房水及玻璃体，但通透性相对较差，在血中的高峰浓度是房水中高峰浓度的20倍，玻璃体的800倍。冰片的相对分子量为，为小分子脂溶性单萜类物质，在胃部吸收迅速，进入体循环后极易通过血脑屏障而进入脑内，[14,15]实验证实，小鼠口服冰片5min后即可进入脑组织，冰片血清和脑组织中的达峰浓度分别是20min和45min，所以本实验选择在冰片灌胃15min使冰片在血液中一定浓度后静脉注射复方丹参，以便发挥冰片的最佳促渗透作用。从实验可以看出，丹参素与冰片合用，检测血清中作为示宗物质的丹参素，