改良羊水细胞培养技术在产前诊断中的应用

改良羊水细胞培养技术在产前诊断中的应用

【关键词】羊水；细胞培养；产前诊断；染色体；核型分析；羊水细胞直接培养

羊水细胞培养及染色体制备是产前诊断染色体病的主要手段[1]。由于羊水细胞培养一直存在技术要求高、难度大、培养时间长、易污染、分裂相少等问题，许多医疗单位的产前诊断中仍未能开展羊水细胞检测工作。多年来，世界各地对羊水细胞的培养及其在染色体制片上虽然不断改进，但羊水细胞培养与染色体制片仍有一定难度。近年来针对羊水细胞培养技术进行了探索和改良，对孕18~24W孕妇，实施羊膜腔穿刺术抽取羊水，将羊水细胞液直接作用于培养瓶底部进行培养。此改良羊水细胞培养技术，可减少细胞大量丢失，获得有效地细胞克隆，大大提高培养成功率，现报告如下。

1资料与方法

资料来源

2004-2007年，100例经产前筛查提示高危者和遗传咨询门诊的有不良妊产史的孕妇，年龄26～40岁，孕周18～24W，在孕妇知情同意后实施羊膜腔穿刺术。

方法

羊水采集方法B超引导定位，无菌条件下，采用7号腰穿针穿刺。最先用5ml注射器抽取2ml羊水弃去，再换10ml注射器抽取羊水共30ml，分别注入一次性无菌离心管中。

改良羊水细胞直接培养以1000r/min离心8min弃去上清液,保留每管ml羊水细胞层,以滴管打匀,分别接种于50ml培养瓶底部,拧紧瓶盖放置超净工作台中静止30min，再沿培养瓶边缘缓缓加入4ml羊水培养液，使其覆盖细胞悬液，并拧紧瓶盖置于37℃恒温培养箱中培养。6d后，更换培养液并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。镜下可见培养瓶底有若干较好的梭形细胞，继续培养并每天观察。2～3d后，小堆细胞已长成大的克隆，并出现成对圆形透亮细胞时，即可进行细胞收获。若贴壁细胞生长缓慢，可弃掉培养瓶中的液体，加入新鲜的培养液继续培养，直到贴壁细胞生长良好为止。平均在培养后9～11d进行细胞收获，终止前4h加入秋水仙素25g/L1滴,最终浓度为50g/L或加入秋水仙素g/L一滴，最终浓度为25g/L，处理15h，使细胞停止在分裂相中期。在倒置显微镜下可见许多分裂相细胞核，细胞圆而大，相互联接。

严重血性羊水的处理羊水标本中渗有少量红细胞不需处理，如遇到严重血性羊水，立即在羊水中加入无菌肝素1滴或以1000r/min，离心8min后，吸取上清液及沉淀液表层于无菌离心管，形成ml羊水细胞悬液，以备接种使用。换液时，需摇动培养瓶，倒出液体加入等量培养基。

羊水细胞收获收获时将细胞刮沿培养瓶底轻轻刮下克隆细胞，利用倒置显微镜可观察克隆细胞已经漂浮起，吸入离心管。再用75%生理盐水冲洗，使其完全脱落后，以1000r/min，离心8min，吸取上清液，留ml悬液备用。

低渗在ml悬液管中加入已置37℃预温的75%KCl低渗液3ml，并用手指轻弹管锥或用滴管轻轻吸打，使其混匀，置37℃水浴箱中低渗5min后。以1000r/min，离心8min，吸取上清液，留ml悬液沿管壁滴入新鲜配置的固定液4ml，用手指轻弹管锥或用滴管轻轻吸打，使细胞均匀分开，2次固定60min后冰箱过夜。

显带常规制片，80℃烤片3h，胰酶消化，G显带染色。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN1995)标准进行核型分析诊断。常规计数15个，分析3个分散良好的细胞核型，异常核型的要计数30个分裂相。

2结果

100例孕妇的羊水细胞培养，1次性羊水穿刺培养成功93例，2次羊水穿刺成功4例，总成功率为97%。培养收获时间大多数为9~12d，最短收获为9d，最长13d。

超过35岁高龄孕妇36例，占总数36%；产前筛查高危42例，占总数42%；有不良妊产史17例，占总数17%；TORCH病毒阳性3例，占总数3%；夫妻一方为平衡易位携带者2例，占总数2%。

在培养成功的97例中，染色体正常核型93例，异常核型3例。异常检出率%，其中1例为47，XY，+21，行引产术；1例为46，XY，-15+t，行引产术；1例为45，X，+21/46，XY。

3讨论

改良羊水细胞培养

影响羊水细胞培养成功率的因素很多。高质量的羊水细胞培养及收获技术是进行羊水染色体分析诊断的关键。因此，在改良羊水细胞直接培养技术方面注重了孕周的选择、种植的技术、培养的环境及收获时间。通过羊水采集培养发现孕周小于18W的羊水，其中脱落细胞较少，贴壁的羊水细胞相对更少。而大于25W的羊水中有形成分增多，严重地影响了活细胞的贴壁。因此，确定羊水最佳采集时间在孕18~24W，此时羊水细胞为生长旺盛期，形成的圆形、双圆形细胞较多，成功率较高。在无CO2培养箱的情况下，根据羊水脱落细胞少，制取过程易丢失的情况，改良原来的种植方法，采取将羊水细胞悬液直接滴于培养瓶底部，经过短暂静止后再加入培养基进行培养，使细胞分布相对集中，减少了细胞大量丢失，并获得

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