发酵液的预处理细胞破碎与固液分离

关于发酵液的预处理细胞破碎与固液分离第1页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三待处理杂质的影响金属离子粘稠物蛋白质第2页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.1.1.1发酵液杂质的去除1.无机离子的去除(首先考虑：离子交换法)Ca2+Mg2+Fe2+草酸、草酸钠，→形成草酸钙沉淀（注意回收草酸）

；三聚磷酸钠，→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+

黄血盐，→普鲁士蓝沉淀Fe3+赤血盐，→滕氏蓝沉淀3Fe2++2K3Fe(CN)6→Fe3[Fe(CN)6]2↓+6K+

第3页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.蛋白质的去除（1）Savage去除蛋白质（蛋白质处于两相之间）正丁醇：氯仿=1：4（5）该法条件温和，可避免多糖的降解，但除蛋白质效率低。（2）三氯乙酸去除蛋白质向多糖溶液加入1/5体积10%的三氯乙酸溶液磁力搅拌30

min，离心去除沉淀。缺点是易引起某些多糖的降解。在280nm出测定光吸收值（3）蛋白质酶去除蛋白质

第4页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.1.1.2改善培养液的性能（1）加热法除去某些热敏性杂蛋白，降低黏度，有利过滤（如糖液热过滤）。取决于产品的热稳定性、能耗。一般加热65-80℃。（2）调节pH值第5页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三（3）凝聚和絮凝凝聚：中和电荷，通常细菌的表面都带有负电荷工业上常用阳离子型。无机盐类：Al2(SO4)3，KAl(SO4)2•18H2O,Fe2(SO4)3，FeSO4，ZnSO4,AlCl3,ZnCl2金属氢氧化物或氧化物：

Fe(OH)3,Al(OH)3,Ca(OH)2；CaO等高价金属。第6页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三

絮凝絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如—COOH）或阳离子（如—NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。第7页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三絮凝剂种类阴离子型阳离子型非离子型聚丙烯酸钠（无毒，食品医药可用）和聚苯乙烯磺酸聚丙烯酸二烷基胺乙酯和聚二丙基四胺盐聚氧化乙烯第8页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（PAM）是目前工业应用最广泛的高分子絮凝剂之一。阴、阳、两性、非离子型：分别用阴、阳、非离子单体和丙烯酰胺共聚而成的线形离分子聚合物。优点：种类多，用量少，ppm级，絮凝体粗大，效果好，速度快。缺点：聚丙烯酰胺本身无毒，但是其单体有毒。

特别是阳离子型，食品医药谨用。第9页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三食品和医药工业常用絮凝剂阴离子型：聚丙烯酸钠（无毒，食品医药可用）和聚苯乙烯磺酸；无机高分子聚合物絮凝剂：聚合铝盐、聚合铁盐；天然有机高分子絮凝剂：丹宁，明胶，壳聚糖。第10页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三聚合氯化铁第11页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.1.2

发酵液的固液分离

重力沉降浮选双水相萃取微孔过滤：固液相分离不完全，浓缩液中

70-80%水（常规过滤固相含水30-40%）工业上常用过滤离心第12页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.1.2.1

过滤

（1）影响过滤速度的因素菌种发酵条件第13页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三真菌细菌放线菌第14页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三菌种对过滤的影响

：菌丝粗，易过滤，不需特殊处理，可用真空转筒过滤机。如青霉菌的菌丝直径可达10μm。：菌丝细而分支，交织成网络状，过滤困难，一般须预处理。链霉素菌丝：0.5-1.0μm。（抗生素约70%是放线菌产生）：菌体更细小，过滤十分困难，如不用絮凝等方法预处理，很难用过滤和分离法操作。0.5~5μm真菌放线菌细菌第15页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三过滤助剂过滤助剂可解决两个问题滤饼的可压缩性问题小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转鼓真空过滤预覆盖层内部，堵塞部分孔。常用的过滤助剂

硅藻土、珍珠岩、活性白土第16页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三助滤剂两种加入方法预先铺一层助滤剂(1~2mm)助滤剂用量等于悬浮液中固体含量第17页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三（2）过滤设备板框过滤机真空转鼓过滤机加压叶滤机带式过滤机袋式过滤机第18页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三板框过滤机第19页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三板框过滤机优点板框压滤机的过滤面积大；过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差；结构简单，价格低；动力消耗少等优点。缺点不能连续操作，设备笨重，劳动强度大；卫生条件差；非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。第20页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三真空转鼓过滤机优点：能连续操作，能实现自动化控制缺点：压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。第21页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三带式压滤机第22页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三PBF系列连续水平真空带式过滤机

紧凑带式过滤机第23页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三加压叶滤机（立式）适合于固体含量少于0.1%第24页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.1.2.2离心优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好，操作时卫生条件好；缺点：设备投资高、能耗大。第25页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三项目低速离心机高速离心机超离心机转速（r/min)2000-600010000-2600030000-12000离心力（g）2000-70008000-800000100000-600000细胞细胞核细胞器蛋白质表2.3离心机的种类和适用范围第26页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三离心力计算离心转速r=5000

r/min，半径R=30

cm，离心力？gZg=8385gZ=1.118×10-5×(r)2×R第27页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三超离心法

分为：差速离心，区带离心。差速离心(differentialcentrifugation)

主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。第28页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三区带离心（Zonalcentrifugation）

密度梯度制作：先调配不同浓度（密度）的蔗糖溶液，然后在离心管中以浓度从大到小层层加入即可。将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速离心后可制成连续的蔗糖密度梯度。CsCl和NaBr在离心力的作用下可自动形成密度梯度。第29页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三三足式离心机第30页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三碟片式离心机第31页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三管式离心机第32页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.2细胞破碎

胞内产物：胞内酶（青霉素酰化酶，碱性磷酸酯酶），脂类，甾族化合物（萃取法提取），遗传工程菌生产的蛋白质及某些抗生素。第33页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三图2.8真核细胞结构示意图细胞壁叶绿体高尔基体线粒体核糖体内质网核细胞膜2.2.1细胞的结构动物、植物和微生物细胞的结构相差很大。第34页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三生物细胞

类型G+细菌G-细菌酵母菌霉菌植物细胞组成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白质(6-8%)脂类(8.5-13.5%)多聚糖(几丁质)(80-90%)脂类蛋白质初生壁次生壁（纤维素，半纤维素，木质素）第35页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三图2.9细胞破碎机理第36页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.2.3细胞破碎技术2.2.3.1机械破碎高压匀浆器球磨机超声波破碎非机械方法：辅助方法2.2.3.2化学和生物化学渗透（1）酸碱处理；（2）化学试剂处理；（3）酶溶2.2.3.3物理渗透法（1）渗透压冲击；（2）冻结-融化法工业上常用实验室常用第37页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.2.3.1机械破碎（1）高压匀浆法细胞悬浮液细胞匀浆液碰撞环图2.11高压匀浆器结构简图阀阀座第38页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三第39页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三破碎原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速（可达450m/s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。操作压力通常为50-70MPa。第40页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三团状或丝状真菌：堵塞较小的革兰氏阳性菌：太小含有包含体的基因工程菌：太坚硬不宜采用高压匀浆法的细胞类型第41页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三（2）球磨法球磨机研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠或氧化锆一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。微珠填充率是细胞的80-85%，微珠与目标细胞的直径比30-100之间。第42页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三细胞悬浮液微珠冷却剂冷却剂细胞匀浆液搅拌桨液珠分离器图2.13珠磨机结构简图第43页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三玻璃珠氧化锆第44页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理；在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。第45页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三胶体磨第46页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三德国进口珠磨机（立式）高速组织捣碎机第47页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三

细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。

特点

超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。该法在实验室小规模细胞破碎中常用。（3）超声波法第48页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三超声波破碎仪第49页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三第50页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.2.3.2化学和生物化学渗透酸碱处理可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。化学试剂处理

表面活性剂：十二烷基磺酸钠（SDS)，TritonX-100,十四烷基胺盐(CTAB);

螯合剂：乙二胺四乙酸（EDTA），与金属离子结合，如阴性菌外层Mg2+、Ca2+处理的方法;

有机溶剂:如苯、甲苯、丁醇、丙酮、氯仿及尿素。这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。第51页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三酶溶法

利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。优点：专一性强，发生酶解的条件温和。缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。第52页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三

（1）细菌：溶菌酶lysozyme

革兰氏阳性菌：溶菌酶革兰氏阴性菌：溶菌酶+EDTA（破坏脂多糖）（2）酵母：Zymolyase，葡聚糖酶或甘露糖酶（3）植物细胞壁：纤维素酶可将化学法与机械法结合起来。溶菌酶、多糖水解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆法处理6次，破碎率95%以上。第53页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三另一种酶解方法，溶胞酶是由微生物本身产生的。影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。例

酵母45~50℃，保温20小时。

谷氨酸菌：加0.028MNa2CO3和0.018MNaOH，pH10，3%悬浮液，加热至70℃，保温搅拌20min，自溶。特点自溶法在一定程度上能用于工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。自溶作用第54页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三干燥法热空气干燥：适用于酵母，25-35℃热空气吹干后的酵母有部分自溶，然后用水、缓冲溶液或其它溶剂抽提。真空干燥：适用于细菌。冷冻干燥：适用于不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冻条件下磨成粉，然后用缓冲溶液抽提。一般配成10-40%的菌悬液进行冷冻干燥，经冻干后的细胞渗透性能大大变化，便于抽提。第55页，讲稿共59页，2023年5月2日，星期三2.2.3.3物理渗透法（1）渗透压冲击（Osmoticshock）是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定