血红蛋白的提取和分离(经典)

4、基本组成单位氨基酸5、氨基酸通式RHCCOOHNH26、氨基酸连接方式脱水缩合写出氨基酸脱水缩合形成二肽示意图本文档共90页；当前第1页；编辑于星期一\21点8分氨基酸的结合方式CHCOOHR1CHNH2COOHR2NH2COHNHOH本文档共90页；当前第2页；编辑于星期一\21点8分氨基酸的结合方式CHR1NH2OHCOH2OCHCOOHR2HNH本文档共90页；当前第3页；编辑于星期一\21点8分氨基酸的结合方式:CHR1NH2COCHCOOHR2HNH2O二肽肽键脱水缩合本文档共90页；当前第4页；编辑于星期一\21点8分氨基酸的结合方式:脱水缩合肽键CHCOOHR3HNOHHCCHR1NH2COCHR2HNO二肽H2OH2O本文档共90页；当前第5页；编辑于星期一\21点8分氨基酸的结合方式:脱水缩合CCHR1NH2COCHR2HNO肽键二肽CHCOOHR3HNH2O肽键三肽以此类推，由多个氨基酸分子缩合而成的含有多个肽键的化合物，叫多肽（链状）。肽链盘曲，折叠，形成有一定空间结构的蛋白质分子。H2O本文档共90页；当前第6页；编辑于星期一\21点8分8、分子结构7、肽键CONH氨基酸肽链蛋白质脱水缩合盘曲折叠（一条或者多条）本文档共90页；当前第7页；编辑于星期一\21点8分10、生理功能细胞和生物体的结构物质，是人体发育和组织更新的主要原料，具有运输、调节、免疫、催化等作用，是一切生命活动的主要承担者氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别9、蛋白质结构的多样性本文档共90页；当前第8页；编辑于星期一\21点8分①氨基酸间脱水缩合时，原来的氨基和羧基就不存在了，形成的化合物即多肽的一端只有一个氨基，另一端只有一个羧基（不计R基上的氨基和羧基）。所以对于一条多肽链说，至少应有的氨基和羧基都是一个②若有个n氨基酸分子缩和成m条肽链,则可形成________个肽键,脱去______个水分子，至有氨基和羧基各____个11、相关计算n-mn-mm本文档共90页；当前第9页；编辑于星期一\21点8分③蛋白质可以含有一条或n条肽链、肽链通过化学键（如二硫键）互相连接，具有不同的空间结构本文档共90页；当前第10页；编辑于星期一\21点8分本文档共90页；当前第11页；编辑于星期一\21点8分④关于蛋白质相对分子量的计算：n个氨基酸形成m条肽链，每个氨基酸的平均相对质量为a,那么由此形成的蛋白质的相对分子量为______________n·a-(n-m)·18本文档共90页；当前第12页；编辑于星期一\21点8分本文档共90页；当前第13页；编辑于星期一\21点8分血红蛋白本文档共90页；当前第14页；编辑于星期一\21点8分思考1

高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？变性、变性、空间结构思考2

人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。本文档共90页；当前第15页；编辑于星期一\21点8分本课题学习目标

体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2、主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4、课题难点：

①样品的处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。本文档共90页；当前第16页；编辑于星期一\21点8分

1、凝胶色谱法凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一，又称分子筛层析。凝胶实际上是一些微小的多孔球体，例如：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等一、基本概念及原理本文档共90页；当前第17页；编辑于星期一\21点8分原理：当不同的蛋白质通过凝胶时相对分子质量较小相对分子质量较大凝胶内部的通道容易进入无法进入凝胶内部的通道只能在凝胶外部移动路程较长移动速度较慢路程较短移动速度较快相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。本文档共90页；当前第18页；编辑于星期一\21点8分4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程本文档共90页；当前第19页；编辑于星期一\21点8分凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示

本文档共90页；当前第20页；编辑于星期一\21点8分本文档共90页；当前第21页；编辑于星期一\21点8分二、缓冲溶液

在一定范围内，能够抵制

对溶液PH值的影响，维持PH

不变。1.作用:2.配制:

通常由

溶解于水中配制而成。调节缓冲剂

的就可以制得在

使用的缓冲液。3.提问：在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:

利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)磷酸缓冲液外界的酸和碱基本1~2种缓冲剂使用比例不同PH范围内思考：说出人体血液中缓冲对。

NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3本文档共90页；当前第22页；编辑于星期一\21点8分三、电泳血红蛋白的分离鉴定方法1.概念：带电粒子在

作用下发生

的过程。2.原理：

许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有

的基团，在一定的PH下，这些基团会带上

或

。在电场的作用下，这些带电分子会向着的

的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子

以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中各种分子的分离。3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。电场迁移可解离正电负电与其所带电荷相反带电性质的差异大小形状迁移速度本文档共90页；当前第23页；编辑于星期一\21点8分

最常用的电泳支持介质是聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）本文档共90页；当前第24页；编辑于星期一\21点8分

在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图本文档共90页；当前第25页；编辑于星期一\21点8分迷你双垂直电泳槽等电聚焦多用电泳槽卧式电泳槽电泳槽9本文档共90页；当前第26页；编辑于星期一\21点8分

（1）、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于

等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小（2）、SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于（）。分子的大小SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）本文档共90页；当前第27页；编辑于星期一\21点8分聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图

（A为正面，B为剖面）

1：样品胶pH6.72：浓缩胶pH6.7

3：分离胶pH8.9

4：电极缓冲液pH8.310本文档共90页；当前第28页；编辑于星期一\21点8分①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所带电荷的性质和分子的大小、形状。本文档共90页；当前第29页；编辑于星期一\21点8分【典例1】有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是A.它们都是分离蛋白质的重要方法B.它们的原理相同C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要D.以上说法都正确

【解题关键】解答本题的关键应明确以下两点：(1)凝胶色谱法的原理；(2)电泳法的原理。A本文档共90页；当前第30页；编辑于星期一\21点8分二、实验步骤蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定（电泳）本文档共90页；当前第31页；编辑于星期一\21点8分实验操作样品处理（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程红细胞的洗涤粗分离：血红蛋白的释放分离血红蛋白溶液纯化：纯度鉴定透析—去除样品中分子量较小的杂质用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳本文档共90页；当前第32页；编辑于星期一\21点8分血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2.血液有哪些成分？

1.用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白本文档共90页；当前第33页；编辑于星期一\21点8分本文档共90页；当前第34页；编辑于星期一\21点8分血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：本文档共90页；当前第35页；编辑于星期一\21点8分采集得到血液（加入抗凝血剂柠檬酸钠）本文档共90页；当前第36页；编辑于星期一\21点8分（1）红细胞的洗涤A、洗涤目的:B、分离时采用

离心，用

洗涤，重复洗涤

，直至

C、能否用蒸馏水代替生理盐水？去除杂质血浆蛋白，以利于后续步骤的分离纯化低速短时间五倍体积的生理盐水三次

上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净不能，生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大分离难度。本文档共90页；当前第37页；编辑于星期一\21点8分初次离心后的结果3次洗涤后的结果本文档共90页；当前第38页；编辑于星期一\21点8分（2）释放血红蛋白思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？为了加速释放过程，采取了什么措施？

（使用磁力搅拌器充分搅拌）目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂本文档共90页；当前第39页；编辑于星期一\21点8分磁力搅拌器本文档共90页；当前第40页；编辑于星期一\21点8分搅拌器转子本文档共90页；当前第41页；编辑于星期一\21点8分搅拌器正在工作本文档共90页；当前第42页；编辑于星期一\21点8分（3）分离血红蛋白溶液：

用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。本文档共90页；当前第43页；编辑于星期一\21点8分甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次本文档共90页；当前第44页；编辑于星期一\21点8分柜式离心机本文档共90页；当前第45页；编辑于星期一\21点8分

2.粗分离透析（去除分子量较小的杂质）（1）用

方法进行粗分离，透析袋由半透膜制成，常用。将透析袋放入

溶液中进行透析。（2）透析的原理是（3）透析的目的是

。

透析玻璃纸、肠衣、膀胱膜

透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内去除样品中分子量较小的杂质磷酸缓冲本文档共90页；当前第46页；编辑于星期一\21点8分本文档共90页；当前第47页；编辑于星期一\21点8分透析过程动画演示本文档共90页；当前第48页；编辑于星期一\21点8分（1）凝胶色谱柱的制作①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

3、纯化（凝胶色谱）去除相对分子量较大的杂质蛋白

本文档共90页；当前第49页；编辑于星期一\21点8分凝胶色谱柱的制作本文档共90页；当前第50页；编辑于星期一\21点8分（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。

②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。③凝胶色谱柱的装填方法：

A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。

B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。本文档共90页；当前第51页；编辑于星期一\21点8分教材P70：为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。思考本文档共90页；当前第52页；编辑于星期一\21点8分装配好的凝胶柱本文档共90页；当前第53页；编辑于星期一\21点8分(3）样品加入与洗脱①加样前打开下端出口，使柱内凝胶面上的（）缓慢下降到与（）平齐，关闭出口缓冲液凝胶面本文档共90页；当前第54页；编辑于星期一\21点8分注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。②加透析样品本文档共90页；当前第55页；编辑于星期一\21点8分本文档共90页；当前第56页；编辑于星期一\21点8分本文档共90页；当前第57页；编辑于星期一\21点8分立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱材料：交联葡聚糖凝胶G-75

20mmol/L磷酸缓冲液“G”表示什么？75代表什么？本文档共90页；当前第58页；编辑于星期一\21点8分3.样品的加入和洗脱

1.调液面2.加样3.再调液面

4.洗脱5.收集缓冲液凝胶本文档共90页；当前第59页；编辑于星期一\21点8分①调整缓冲液面：与凝胶面平齐②滴加透析样品：加到色谱柱的（）③样品渗入凝胶床：（）④再调整缓冲液面洗脱：⑤收集：待（）接近色谱柱底端时收集顶端样品完全进凝胶层红色的蛋白质色谱柱制作成功的标志：红色区带均匀一致的移动记本文档共90页；当前第60页；编辑于星期一\21点8分4、纯度鉴定（电泳）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。1、垂直板电泳装置2、稳流稳压电泳仪；3、微量进样器（可用微量移液器代替）本文档共90页；当前第61页；编辑于星期一\21点8分（1）、胶板的制备：①.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干②.把玻璃板在灌胶支架上固定好本文档共90页；当前第62页；编辑于星期一\21点8分

（2）、分离胶的制备：

按下表制备分离胶(T=12%,pH=8.8)试剂双蒸水分离胶缓冲液丙胶贮液ApTEMED

用量1.65mL1.3mL

2.0mL0.05mL0.002mL

胶灌至距梳子齿下端1cm→灌毕→封上一层水→当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。本文档共90页；当前第63页；编辑于星期一\21点8分（3）、浓缩胶的制备：按下表制备浓缩胶(T=4%,pH=6.8)试剂双蒸水浓缩胶缓冲液丙胶贮液ApTEMED用量1.46mL0.25mL 0.27mL0.02mL0.002mL

用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→聚合。本文档共90页；当前第64页；编辑于星期一\21点8分（4）、取样

取纯化后的血红蛋白样品10μL加入10μL上样buffer（内含少许溴酚蓝的40％蔗糖）混匀。本文档共90页；当前第65页；编辑于星期一\21点8分（5）装槽、点样：

拔出梳子→将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）→在电泳槽中加入缓冲液→点样。本文档共90页；当前第66页；编辑于星期一\21点8分本文档共90页；当前第67页；编辑于星期一\21点8分（6）电泳：本文档共90页；当前第68页；编辑于星期一\21点8分（7)、剥胶、染色及脱色

凝胶板剥离：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加染色液染色，然后用脱色液脱色。本文档共90页；当前第69页；编辑于星期一\21点8分(8)、结果本文档共90页；当前第70页；编辑于星期一\21点8分

1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。

2、TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。

3、在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。注意事项：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳本文档共90页；当前第71页；编辑于星期一\21点8分影响蛋白质分子运动速度的因素√√√√√√√本文档共90页；当前第72页；编辑于星期一\21点8分思考下面的问题：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液（离心）等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。本文档共90页；当前第73页；编辑于星期一\21点8分【典例2】(2011·扬州高二检测)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：本文档共90页；当前第74页；编辑于星期一\21点8分(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有____________功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是____________；乙装置中，C溶液的作用是_____________________________。(3)甲装置用于____________，目的是__________________________________。用乙装置分离蛋白质的方法叫____________，是根据_________________分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_____________-_________时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。运输磷酸缓冲液洗脱血红蛋白透析(粗分离)去除样品中相对分子质量较小的杂质凝胶色谱法相对分子质量的大小红色的蛋白质接近色谱柱底端本文档共90页；当前第75页；编辑于星期一\21点8分

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价

1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

本文档共90页；当前第76页；编辑于星期一\21点8分

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？本文档共90页；当前第77页；编辑于星期一\21点8分 教学反馈1．凝胶色谱法是根据（）分离蛋白质的有效方法。A分子的大小B相对分子质量的大小C带电荷的多少D溶解度2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。A温度BpHC渗透压D氧气浓度3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（）的电极移动。A相同B相反C相对D相向4.哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。A血红蛋白B肌红蛋白C肌动蛋白D肌球蛋白BBBA本文档共90页；当前第78页；编辑于星期一\21点8分5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。A白细胞B血小板C红细胞D淋巴细胞6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。A.NaClB.甲苯C.蒸馏水D.柠檬酸钠7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（）A无色透明的甲苯层B脂溶性物质的沉淀层C血红蛋白的水溶液D其他杂质的暗红色沉淀物CDC本文档共90页；当前第79页；编辑于星期一\21点8分1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是A弄清各种蛋白质的空间结构B弄清各种蛋白质的功能C弄清各种蛋白质的合成过程D获得高纯度的蛋白质本文档共90页；当前第80页；编辑于星期一\21点8分2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D二者根本无法比较本文档共90页；当前第81页；编辑于星期一\21点8分3、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是A调节pHB维持红细胞的能量供应C防止微生物生长D防止血液凝固本文档共90页；当前第82页；编辑于星期一\21点8分6、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序自上而下是：有机溶剂脂类物质血红蛋白溶液红细胞破碎物沉淀本文档共90页；当前第83页；编辑于星期一\21点8分1.答:凝胶色谱法也称为分配色谱法,它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一.所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体,这些小球体大多数是由多糖类化合物构成,小球体内部有许多贯穿的通道,当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时,各分子在色谱柱内进行两种不同的运动,即垂直向下的运动和无规则的扩散运动.相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢.因此,样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最小的分子最后流出,这种现象又叫分子筛现象.1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的?课后练习本文档共90页；当前第84页；编辑于星期一\21点8分答:在一定范围内,能对抗外来少量强酸,强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液.缓冲溶液通常是由一或两种缓冲剂溶解于水中制得,调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液.

缓冲溶液的作用维持反应体系的pH不变.在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的,受到氢离子浓度的严格调控.为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境,就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH.

2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么?本文档共90页；当前第85页；编辑于星期一\21点8分原理：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.许多重要的生物大分子,如氨基酸,多肽,蛋白质,核苷酸,核酸等都具有可解离基团,它们在某个特定的pH下会带上正电或负电;在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动.作用：电泳技术就是在电场的作用下,利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小,形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而达到对样品进行分离,鉴定或提纯的目的.

3.电泳的作用及其原理是什么?本文档共90页；当前第86页；编辑于星期一\21点8分答:血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,包括:样品处理,粗分离,纯化和纯度鉴定.首先通过洗涤红细胞,血红蛋白的释放,离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样品的处理;再经过透析去除分子量较小的杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化;最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定.

答:血红蛋白是有色蛋白,因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液.这使血红蛋白的分离过程非常直观,大大简化了实验操作.

4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗?5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义?本文档共90页；当前第87页；编辑于星期一\21点8分3、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳：2.试剂的配制：鉴定血红蛋白纯度。1.目的：

①丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺:

用去离子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-亚甲基双丙烯酰胺的贮存液。②十二烷基硫酸钠（SDS）:

用去离子水配成10%的贮存液，于室温保存。③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液。④TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。⑤用去离子水配制10%过硫酸铵：作用是提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自