三种荧光定量PCR检测方法比较

./三种荧光定量PCR检测方法比较定量pcr：以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。常见荧光定量PCR检测方法可分为以下几类：<1>SYBRGreenI检测模式SYBRGreenI是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后,荧光大大增强。因此,SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关,可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm,发射波长最大约为520nm。PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法,40个循环。SYBRGreenI的缺点：由于SYBRGreenI没有特异性,不能识别特定的双链,只要是双链就会结合发光,对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光,通常本底较高,所以在临床上使用可能会有假阳性发生。SYBRGreenI的优点：SYBRGreenI的优点是因为其缺点产生,由于它能所有的双链DNA相结合,所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针,通用性较好,并且价格相对较低。这对科研是很有利的,因此国内外在科研中使用比较普遍。<2>水解探针模式<taqman探针>TaqMan探针是一种寡核苷酸探针,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭剂则在3’末端。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。在进行延伸反应时,聚合酶的5’外切酶活性将探针切断,使得荧光基团与淬灭剂分离,发射荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累。因此Taqman探针检测的是积累荧光。PCR扩增程序通常是：94℃～60℃40个循环。常用的荧光基团是FAM,TET,VIC,HEX。<3>杂交探针模式<Beacon、FRET>分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,两端的核酸序列互补配对,因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭,由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。分子信标的茎环结构中,环一般为15-30个核苷酸长,并与目标序列互补;茎一般5-7个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。荧光基团标记在探针的一端,而淬灭剂则标记在另一端。在复性温度下,因为模板不存在时形成茎环结构,当加热变性会互补配对的茎环双链解开,如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后,分子信标将成链状而非发夹状,使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时,因淬灭作用被解除,发出激发光子。由于是酶切作用的存在,分子信标也是积累荧光。常用的荧光基团：FAM,TexasRed。PCR扩增程序通常是：94～55～72℃三步法,40个循环。FRET探针又称双杂交探针,FRET探针由两条相邻探针组成,在一条探针的5`端标记FAM荧光基团,另一探针的3`端标记Red640荧光基团。当复性时,探针结合在模板上,FAM基团和Red640基团相邻,激发FAM产生的荧光,作为Red640基团的激发光被吸收,使Red640发出波长为640的荧光。当变性时,探针游离,两基团距离远,不能产生640波长的荧光。由于FRET探针是靠近发光,所以检测信号是实时信号,非累积信号。常用的荧光基团是：LC-Red640,LC-Red705。能用于实时荧光PCR定量的方法很多,各有优缺点,应根据实验的需要和当前的实验条件选择适合自己的方法。下面为各种方法的比较：实验中的一些好习惯：加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均;移液枪用完之后要归到最大计量的位置,防止久而久之弹簧失去弹性。一定要记着关水浴箱,切记切记;多和大家讨论,同时多关注别人讨论的经验,这几乎是最快提高的捷径了;所有的试剂都自己配,出了问题才好找原因。防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗<注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用>。3.有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H2O2室温10min,然后用0.1%DEPC水冲洗,晾干。4.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室,所有器械等应为专用。常用的RNA酶抑制剂：1.焦磷酸二乙酯<DEPC>：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂<RNasin>：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。5.其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA,因此在分离和纯化RNA过程中不能使用,而且它与一些缓冲液<例如Tri>不能相容在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶<RNA酶>的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理动植物总RNA提取-Trizol法：Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交,Poly<A>+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。1.将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2.研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。3.取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。4.弃去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。5.小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。[注意]1.整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。另外,提取上清这步一定要小心,靠近沉淀的部分一定要舍得不要,要不然会有蛋白质污染,影响比值2.加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。总mRNA的提取经验：一、关于TrizolReagent需要的试剂1.Chloroform：氯仿<分析纯>2.Isoproplylalcohol：异丙醇<分析纯>3.75%Ethanol<inDEPC-treatedwater>：75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。4.RNase-freewater：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%<V/V>加在dH2O中500ml<50ul>,在37℃过夜,并高压灭菌即得<150℃3小时>5.一次性塑料手套6.注意：DEPC有致癌之嫌二、关于TrizolReagent的使用过程：1.Homogenization<匀浆>a.Tissues：组织每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂,样品体积不能超过Trizol试剂的10%。b.CellsGrowninmonolayer<单层细胞接毒后出现病变的>针对JEV细胞总RNA的抽提法：BHK21细胞长成单层后,接毒0.5-1ml<采用大瓶>,37℃吸附1h,倒掉,加维持液<含2%的血清和HEPE8的MEM>约5ml,维持天。出现75%-100%的病变时,以PBS<预冷>冲洗细胞两次,直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2,吹吸几次,以裂解细胞<细胞瓶有两种常用规格：大的约45cm2,小的约30cm2,故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定,以盖满瓶底为度,而不是依据细胞的数量,否则可导致DNA的污染>具体方法如下：<样品一定要新鲜><1>组织接入预冷的EP管中,加入Trizol试剂1ml/10cm2<量一定要加足,否则易污染>,混匀,吹吸几次,以破裂细胞,置室温5min,以使核蛋白复合物彻底分离。<2>加氯仿0.2ml<每1mlTrizol试剂加入氯仿0.2ml>,盖好,剧烈震荡15s,置室温2-3分钟。<3>4℃离心,10000g×15min,离心后,混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中,水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。<4>仔细吸取上层水相,移至另一EP管中。<5>加0.5ml异丙醇,以沉淀RNA<每1mlTrizol试剂加入0.5ml异丙醇>,置室温10min。<6>4℃离心,10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。<7>弃上清液,加入预冷的75%乙醇1ml<每1mlTrizol试剂加入75%乙醇至少1ml>,震荡,充分洗涤沉淀,4℃离心,5500g×5min。弃上清液,空气干燥<或真空干燥>后,沉淀重悬于无RnasedH2O中,吹吸几次,55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA,-70℃保存备用。<8>抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul,取10ul加无Rnase水990ul,稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中,以无Rnase水为对照,在721型紫外分光光度计下检测,结果应为：A260/280ratio<1.6。<9>分离组织10mg<纯组织>加800ulTrizol试剂。<10>扩增产物的鉴定。DEPC处理方法如下：1.DEPC处理：<1>DEPC水：100ml超纯水加入0.2mlDEPC,充分混匀,高压灭菌。<2>Tip头<枪头>、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材<包括1ml、200μl、20μlTip头;EP管和PCR反应管等>：用0.1%的DEPC水<1000ml超纯水加入1mlDEPC>37℃浸泡过夜,高压灭菌。2.提取RNA,用DEPC水溶解。3.RT：我是用PCR仪来控制温度和时间的,所以RT是在PCR反应管中作的。4.操作过程中要戴一次性手套,并经常换手套。最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下,枪头盒插好枪头后,加入1-2ml的0.1%DEPC水,在灭菌就行了;现在有进口的RNASEFREE的枪头买,直接用不用处理的。如何消除污染：机器运行完后,取出PCR产物时不能随便丢弃,应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。<1>试剂：mixer尽量分装,不要原瓶多次取用。<2>加样：原则是DNA最后加,其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同,那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面,混合均匀之后再分装到各个管子里去,这样可以有效地避免误差及污染。另外,普通实验室容易污染,且污染程度很高,与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系,最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。目前,国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。Uracil-DNAN-glycosylase<UNG>尿嘧啶DNA糖基酶,来源于大肠杆菌重组克隆表达。RNA定量：RNA也最好至少要用电泳,一方面定量,另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。RNA的贮藏,最主要的是温度,-20不够,最好-80,液氮最保险。mRNA是不能代替蛋白水平的分析的,因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响。RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,由此推测是体系更加单一比较利于PCR的进行。一定要做内参的,不作内参的结果是不可信的。电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量mRNA的分离与纯化中。步骤<4>中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNAPoly<A+>尾处的二级结构,使Poly<A+>尾充分暴露,从而提高Poly<A+>RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合,否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。下面,我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。保温试验：方法很简单的,按照样品浓度,从RNA溶液中吸取两份1000ng的RNA加入至0.5ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10ul的总体积,然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。时间到了之后,取出两份样本进行电泳。电泳完成后,比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别<当然,它们的条带也要符合方法2中的条件>,则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染,RNA的质量很好。相反的,如果70℃保温的样本有明显的降解,则说明RNA溶液中有RNA酶污染。PCR污染与对策：PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题,所以,扩增区的仪器什么如枪头等要注意。还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时