维生素类药物的分析1

维生素类药物的分析[基本内容]维生素A、维生素B1、维生素C、维生素D和维生素E的结构和性质、鉴别试验、含量测定，以及游离生育酚的检查。[基本要求]掌握：维生素类药物的结构与分析方法的关系，维生素A的紫外分光光度法，维生素C的碘量法。

本文档共74页；当前第1页；编辑于星期二\5点43分维生素类药物的分析熟悉：维生素A的三氯化锑反应及比色法，维生素E的鉴别试验及气相色谱法，维生素B1的硫色素反应及紫外分光光度法、非水滴定法，维生素C的2，6—二氯吲哚酚滴定法，维生素D的鉴别试验。了解：该类药物的其他分析项目与方法，维生素D含量测定的高效液相色谱法，维生素A三点校正法的推导过程。

本文档共74页；当前第2页；编辑于星期二\5点43分课时安排：总学时：（5学时）维生素A、维生素B1（3学时）重点内容：维生素A的紫外分光光度法

维生素C、D、E；复习及习题（2学时）本文档共74页；当前第3页；编辑于星期二\5点43分概述特点：1.非蛋白质、非脂肪、非糖类的有机化合物.具有较强的生理活性，体内不能合成。2.多为醇、酯、胺、酸、酚和醌类；各具不同的理化性质和生理作用。维生素A(retinal)本文档共74页；当前第4页；编辑于星期二\5点43分维生素D3(colecalciferol，胆骨化醇)维生素B1(Thiaminehydrochloride,盐酸硫胺)本文档共74页；当前第5页；编辑于星期二\5点43分本文档共74页；当前第6页；编辑于星期二\5点43分3.分类:脂溶性和水溶性脂溶性：维生素A、D、E、K等；水溶性：维生素B组(B1、B2等)、烟酸、泛酸、叶酸及抗坏血酸。

其中脂溶性维生素在体内可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变成辅酶对代谢起调节作用。4.测定方法:生物、微生物、化学和物理化学的方法.本文档共74页；当前第7页；编辑于星期二\5点43分第一节维生素A的分析维生素A主要存于动物性食物中，但有色植物中的-胡萝卜素即VA原含量丰富。本文档共74页；当前第8页；编辑于星期二\5点43分第一节维生素A的分析维生素A维生素A1（视黄醇）维生素A2（去氢维生素）维生素A3（去水维生素）全反式维生素A本文档共74页；当前第9页；编辑于星期二\5点43分一、结构与性质维生素A(retinal)★1．共轭多烯结构：具有强紫外吸收（在325—328nm有最大吸收），可采用紫外吸收光谱法进行鉴别，采用紫外分光光度法进行含量测定。存在多种立体异构化合物天然维生素A是全反式维生素A。其它异构体具有相似的化学性质，但生物效价不同。（表9-2）本文档共74页；当前第10页；编辑于星期二\5点43分相对生物效价维生素A（全反）325.5100%新维生素Aa（2-顺）32875%新维生素Ab（4-顺）320.524%新维生素Ac

（2、4-顺）310.515%异维生素Aa（6-顺）32321%异维生素Ab（2、6-顺）32424%本文档共74页；当前第11页；编辑于星期二\5点43分一、结构与性质2.结构式中R的不同，可以形成维生素A醇或其酯。临床上多用其醋酸酯和棕榈酸酯。（表14-1）

3.易氧化变质：有多个不饱和键，性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，生成无活性物质。-H维生素A醇-COCH3维生素A醋酸酯-COC15H31维生素A棕榈酸酯R:去氢维生素A

（A2dehydroretinol)去水维生素A

（A3anhydroretinol)本文档共74页；当前第12页；编辑于星期二\5点43分一、结构与性质4.溶解性：（脂溶性）能与氯仿、乙醚、环己烷或石油醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。★

★5.能与三氯化锑呈色：在氯仿中能与三氯化锑试剂作用，产生不稳定的蓝色。本文档共74页；当前第13页；编辑于星期二\5点43分二、鉴别试验★

★

（一）三氯化锑反应（Carr-Price反应）

维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中，即显蓝色，渐变成紫红色。

蓝色紫红SbCl5本文档共74页；当前第14页；编辑于星期二\5点43分二、鉴别试验[讨论]：1.实际起作用的是三氯化锑(Ⅲ)中存在的Lewis酸氯化高锑(V)2.反应要用无醇氯仿，因为醇的存在要作为亲核反应物与正碳离子反应而使其正电荷消失。3.反应要无水，水可使三氯化锑水解为氧氯化锑。本文档共74页；当前第15页；编辑于星期二\5点43分★（二）紫外吸收特征：1.直接测定——维生素A1

在326nm处有最大吸收。2.酸消去后测定——维生素A3（去水维生素A）在332nm附近有曲折，在348、367、389nm附近有吸收峰。★

1、为什么吸收带红移？2、为什么吸收峰变多？二、鉴别试验VitAVitA3本文档共74页；当前第16页；编辑于星期二\5点43分维生素A(醇)在盐酸存在下解离，随即正电荷转移至β—紫萝酮环上的碳上，然后失去一个质子而生成去水维生素A：本文档共74页；当前第17页；编辑于星期二\5点43分★1、为什么吸收带红移？去水维生素A比维生素A多一个共轭双键，因而红移。Konjugierte吸收Fieser规则、Scoot规则2、为什么吸收峰变多？（思考题，请查询紫外光谱原理的相关资料）

本文档共74页；当前第18页；编辑于星期二\5点43分（三）薄层层析条件1：（BP2000）硅胶板溶剂：环己烷展开剂：环己烷—乙醚（80:20）三氯化锑试剂显色，以标准品同时进行对照条件2：硅胶板溶剂：氯仿展开剂：环己烷—乙醚（80:20）磷钼酸显色，以标准品同时进行对照本文档共74页；当前第19页；编辑于星期二\5点43分三、含量测定维生素A的测定CHP收载三种HPLC法UV三氯化锑法本文档共74页；当前第20页；编辑于星期二\5点43分三、含量测定★

★紫外分光光度法三氯化锑比色法（专属性差，显色不稳定）前者是法定方法，后者多用于食品或饲料中的维生素A的测定（行业方法）。HPLC法具有强紫外吸收（在325—328nm有最大吸收），可采用紫外分光光度法进行含量测定。本文档共74页；当前第21页；编辑于星期二\5点43分★★紫外分光光度法目前各国药典均采用紫外分光光度法测定维生素A的含量。本法快速、准确、经济，测定结果能比较正确地反映维生素A的效价。[如何测定？]1.根据紫外光谱数据:定量维生素A在不同溶剂中的紫外吸收数据其最大吸收峰的位置随溶剂的不同而异本文档共74页；当前第22页；编辑于星期二\5点43分2.能否直接测定？能直接测定的条件：1.仪器符合药典的要求2.溶剂及样品中的基质等其他组分在测定波长处无干扰

（1）而维生素A原料药中常混有杂质，如维生素A2、维生素A3。本文档共74页；当前第23页；编辑于星期二\5点43分（2）维生素A的氧化产物：（3）维生素A在光照下产生的无生物活性的聚合物鲸醇：本文档共74页；当前第24页；编辑于星期二\5点43分

（4）维生素A的顺反异构体；（5）合成时产生的中间体这些杂质在维生素A的最大吸收波长（310—340nm）波长范围内有吸收，干扰维生素A的测定，所测得的吸收度不是维生素A所独有。

所以不能直接测定维生素A的用于定量要消除杂质的干扰——三点校正法本文档共74页；当前第25页；编辑于星期二\5点43分★★三点校正法测定维生素A的含量本法是用在三个波长处测得吸收度，根据校正公式计算吸收度A校正值后，再计算含量。[原理]：①杂质的吸收在310—340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大，吸收度变小。②物质对光的吸收度具有加和性，因而吸收曲线也是他们吸收曲线的叠加。AnmVitAsamplepureVAacetateimpurities本文档共74页；当前第26页；编辑于星期二\5点43分[原则]：最大吸收波长处一点，最大吸收波长的两侧各选一点。1.中国药典测定维生素A醋酸酯——等波长差法在λ1的左右各选一点为λ2和λ3；使λ3—λ1＝λ1—λ2。

规定

λ1＝328nm，λ2＝316nm，λ3＝340nm合成VitA天然鱼肝油本文档共74页；当前第27页；编辑于星期二\5点43分2.中国药典测定维生素A醇——等吸收比法在λ1的左右各选一点为λ2和λ3；使Aλ2＝Aλ3=6/7Aλ1。

规定λ1＝325nm，λ2＝310nm，λ3＝334nm本文档共74页；当前第28页；编辑于星期二\5点43分第一法：测定维生素A醋酸酯的方法——等波长差法基本思想：先判断杂质的干扰是否影响测定及影响程度（五点波长法），再决定用哪个吸收度进行含量计算。1.取维生素A醋酸酯，精密称定，加环己烷制成每1m1中含9—15单位的溶液。然后在300、316、328、340、360nm五个波长处分别测定吸收值。合成VitA天然鱼肝油[测定方法]中国药典本文档共74页；当前第29页；编辑于星期二\5点43分2.A值的选择法:按中国药典附录ⅦJ——维生素A测定法的规定。计算各波长下的吸收度与328nm波长下的吸收度的比值。并确定最大吸收波长(应为328nm)。五个吸收度比值分别与规定的吸收度比值相减，即得到五个差值。判断每个差值是否超过规定的±0.02。本文档共74页；当前第30页；编辑于星期二\5点43分1.理想状况:杂质几乎没有形成干扰。判断标准：最大吸收波长在326～329nm之间，计算吸收度比值Ai/A328，并与规定值相减，差值不超过±0.02A值选择：选择A328计算含量2.非理想状况:杂质有干扰。判断标准（符合以下两点之一）(1)最大吸收波长在326～329nm之间，5个波长下的Ai/A328与规定值之差有一个或几个超过±0.02；(2)最大吸收波长不在326～329nm之间。本文档共74页；当前第31页；编辑于星期二\5点43分A值选择：先计算出：

再计算出

再根据以下三种不同情况选择（1）若所得的数值在±3%，表明杂质干扰很小，则仍用A328计算含量；（2）若所得的数值在-15%～-3%之间，表明杂质有一定的干扰，则需用A328（校正）计算含量；

本文档共74页；当前第32页；编辑于星期二\5点43分[如何计算标示量的百分含量]？第二步：求第三步：求效价（IU/g）：效价系指每克供试品中所含维生素A的国际单位数。如何换算成效价（IU/g）？换算因子：定义为每1个

数值所相当的效价。（C单位为g/100ml）VitA的标示量为效价！本文档共74页；当前第33页；编辑于星期二\5点43分1g维生素A醋酸酯相当的国际单位数为：★★效价IU/g=E1cm1%×1900(溶剂:环己烷)本文档共74页；当前第34页；编辑于星期二\5点43分1g维生素A醇相当的国际单位数为：★★效价IU/g=E1cm1%×1830(溶剂:环己烷)本文档共74页；当前第35页；编辑于星期二\5点43分第四步：求标示量％标示量——样品标签上注明的每胶丸含有的维生素A醋酸酯的国际单位数(效价，非含量！)1.求维生素A醋酸酯胶丸为标示量的百分含量:

IU/丸标示量%=----------×100%标示量IU/丸=IU/g×g/丸=IU/g×W

IU/g×W标示量%=----------------×100%标示量本文档共74页；当前第36页；编辑于星期二\5点43分测定含量单位质量1g对应的效价效价占单位样品质量的百分比效价（标示）占单位质量的百分比本文档共74页；当前第37页；编辑于星期二\5点43分或者：A——直接测得的A328或校正后的A328

(校正)；D——供试品的稀释倍数；1900——换算因数；W——胶丸的平均内容物重量，g；W——称取供试品取量，g；l——比色池厚度，cm；标示量——样品标签上注明的每胶九含有的维生素A醋酸酯的国际单位数。本文档共74页；当前第38页；编辑于星期二\5点43分（3）若所得的数值小于-15%或大于+3%，或最大吸收波长不在326～329nm之间，表明杂质干扰很大，已经不适宜再用本法测定。则应采用第二法（皂化法）测定。图示：

用第二法测定

用A328（校正）计算

用A328计算

用第二法测定

-15%

-3%

0

+3%

本文档共74页；当前第39页；编辑于星期二\5点43分第二法：中国药典适用于维生素A醇（含杂质较多的维生素A）的方法——等吸收比法、6/7A法第一法无法消除杂质干扰时用此法本文档共74页；当前第40页；编辑于星期二\5点43分2.A值的选择法:按中国药典附录ⅦJ——维生素A测定法的规定。

判断max是否在323～327nm之间

计算是否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定本文档共74页；当前第41页；编辑于星期二\5点43分

判断A300/A325是否大于0.73是否取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定

计算A325(校正)本文档共74页；当前第42页；编辑于星期二\5点43分03%－3%本文档共74页；当前第43页；编辑于星期二\5点43分[如何计算含量]？1.求E1cm1%

E1cm1%=A/CL（C单位为g/100ml）

2.求效价（IU/g）：IU/g=E1cm1%×18303.求维生素A醇为标示量的百分含量:

IU/丸标示量%=----------×100%标示量IU/丸=IU/g×g/丸=IU/g×W

IU/g×W标示量%=----------------×100%标示量本文档共74页；当前第44页；编辑于星期二\5点43分A——直接测得的A328或校正后的A328

(校正)；1830——换算因子；D——供试品的稀释倍数；W——胶丸的平均内容物重量，g；W——称取供试品取量，g；l——比色池厚度，cm；标示量——样品标签上注明的每胶九含有的维生素A醋酸酯的国际单位数。本文档共74页；当前第45页；编辑于星期二\5点43分★★关于三点校正法测定维生素A含量方法的讨论1）维生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程式法（即代数法）推导而来：维生素A醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或6/7定位法）推导而来。（了解）

本文档共74页；当前第46页；编辑于星期二\5点43分★★关于三点校正法测定维生素A含量方法的讨论★2）在应用三点校正法时，除其中一点在最大吸收波长处测定外，其余两点均在最大吸收峰的两侧进行测定。如果仪器波长精度不准确时，会产生较大误差。因此：

①在测定前务必要校正波长，（ChP，AppendixIVA）②可用全反式维生素A进行测定，比较测定结果和比值是否与对照品相符合，以进一步核对仪器波长是否准确。③测定的样品应不得少于两份。本文档共74页；当前第47页；编辑于星期二\5点43分★★关于三点校正法测定维生素A含量方法的讨论3）皂化后提取应避免强烈振动以免引起乳化。皂化的全部过程应连氮并应在最短时间内完成。标准品及样品的处理，应避免接触金属器皿。★★4）不适宜用第一法测定的维生素A醋酸酯。改用第二法（皂化法）测定后。其换算因子也相应改为维生素A醇的换算因子1830，计算时必需注意！！★★5）中国药典收载的维生素A胶丸、维生素AD滴剂、维生素AD胶丸等均采用三点校正法测定。

本文档共74页；当前第48页；编辑于星期二\5点43分应用示例一VitAD胶丸中VitA的含量测定精密称取本品(规格10,000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物0.1287g至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度如下，计算VitA的标示量百分含量。本文档共74页；当前第49页；编辑于星期二\5点43分A=A328校正本文档共74页；当前第50页；编辑于星期二\5点43分本文档共74页；当前第51页；编辑于星期二\5点43分维生素A的HPLC法（请自学）色谱条件—正相色谱法！色谱柱：硅胶柱流动相：正己烷-异丙醇（997:3)检测波长325nm外标法：VitA酯本文档共74页；当前第52页；编辑于星期二\5点43分维生素A的三氯化锑比色法[原理]：维生素A与三氯化锑的无水氯仿溶液作用，产生不稳定的蓝色，λmax618nm～620nm，符合Beer定律。[方法]：标准曲线法。[特点]：1.需在5—10秒钟内测定。呈色不稳定2.受温度影响很大3.需要无水条件4、三氯化锑有腐蚀性本文档共74页；当前第53页；编辑于星期二\5点43分5.非专属反应；如新维生素A、去水维生素A及胡萝卜素等物质，均与三氯化锑均显蓝色，故在测定天然维生素A时，测定值往往偏高.6.简易，操作迅速。目前仍为食品或饲料中维生素A测定常用的方法。本文档共74页；当前第54页；编辑于星期二\5点43分第二节水溶性维生素——维生素B1的分析VB1又称盐酸硫胺素，是由一个噻唑环和氨基嘧啶环通过亚甲基连接而成的季铵化合物。在生物体内主要以焦磷酸硫胺素（TPP）形式存在。VB1和糖代谢关系密切，当缺乏时造成丙酮酸积累易引起神经炎和脚气病。本文档共74页；当前第55页；编辑于星期二\5点43分氨基嘧啶环噻唑环亚甲基季铵亦称盐酸硫胺,具有维持糖代谢及神经传导与消化的正常功能，主要用于治疗脚气病、多发性神经炎和胃肠道疾病本文档共74页；当前第56页；编辑于星期二\5点43分一、结构及性质★★结构特点：1．氨基嘧啶环和噻唑环：具有硫色素反应，此反应专属性强，用于鉴别和含量测定。2.母核具N杂环，有弱碱性，1）可以与生物碱沉淀剂反应，产生沉淀，用于鉴别与含量测定。2）可以在冰醋酸中与高氯酸定量反应，用于含量测定。3．共轭体系：具紫外吸收，用于含量测定。4．盐酸根：呈氯化物的反应，用于鉴别。

本文档共74页；当前第57页；编辑于星期二\5点43分一、结构及性质★★理化性质(1)溶解性本品在水中易溶，水溶液显酸性反应。在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。(2)具有紫外吸收本品约12.5μg／m1盐酸溶液(9→1000)，λmax=246nm，百分吸收系数为406—436。(3)在碱性中遇氧化剂，如铁氰化钾，可被氧化为具有荧光的硫色素，后者溶于正丁醇中呈蓝色荧光。

本文档共74页；当前第58页；编辑于星期二\5点43分(4)分子中含有两个杂环(嘧啶环和噻唑环)，故可与某些生物碱沉淀试剂(如碘化汞钾、三硝基酚、碘溶液、硅钨酸等)反应生成组成恒定的沉淀。(5)水溶液呈氯化物的反应，用于鉴别。

(6)干燥品很稳定，酸性水溶液稳定，在碱性溶液中，噻唑环开环，迅速分解。本文档共74页；当前第59页；编辑于星期二\5点43分二、鉴别试验★★(一)硫色素反应硫色素反应为维生素B1所特有，中国药典以此进行鉴别。

(1)原理(2)方法取本品约5mg，加氢氧化钠试液2.5m1溶解后，加铁氰化钾试液0.5m1与正丁醇5m1，强力振摇2min，放置分层，上面的醇层显强烈的蓝色荧光。加酸使成酸性，荧光即消失。再加碱使成碱性，荧光又显出。本文档共74页；当前第60页；编辑于星期二\5点43分本文档共74页；当前第61页；编辑于星期二\5点43分(二)沉淀反应(1)(2)

(3)(4)与苦酮酸作用形成不溶于水的扇形两头弯成螺旋状的白色结晶。其他维生素与苦酮酸不发生反应！嘧啶环——伯氨噻唑环——季铵H+H+本文档共74页；当前第62页；编辑于星期二\5点43分

（三）加碱分解后与醋酸铅反应水溶液加醋醋铅试液和氢氧化钠试液并加热，溶液由黄色→棕色→最后生成黑色沉淀。苛性碱分解维生素B1，产生的硫化钠与醋酸铅作用生成黑色硫化铅沉淀。S元素反应本文档共74页；当前第63页；编辑于星期二\5点43分（四）水溶液显氯化物的特殊反应Cl-反应本文档共74页；当前第64页；编辑于星期二\5点43分三、含量测定

[方法种类]：硅钨酸重量法、BP（1998）硫色素荧光法、USP（24）★非水溶液滴定法、（Chp测定维生素B1原料药）★紫外分光光度法。（Chp测定维生素B1制剂）本文档共74页；当前第65页；编辑于星期二\5点43分

1．硅钨酸重量法简介BP（2000）、Chp（1990）方法维生素B1在酸性溶液中与硅钨酸作用产生沉淀，根据沉淀的重量即可计算其含量。[特点]：原理简单，但操作繁琐费时，试剂易得，结果较为准确。MW：3479.22本文档共74页；当前第66页；编辑于星期二\5点43分2.硫色素荧光法p222USP（24）方法[原理]:盐酸硫胺在碱性溶液中，被氧化剂（如铁氰化钾）氧化生成硫色素，用异丁醇提取，在