免疫细胞的分离技术

关于免疫细胞的分离技术第1页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三

免疫系统的组成免疫系统免疫器官中枢:胸腺、骨髓周围：淋巴结、脾脏、粘膜

相关淋巴组织等免疫细胞：淋巴细胞、单核-巨噬细胞、

粒细胞、DC、肥大细胞、

NK细胞免疫分子：抗体、补体、细胞因子、MHC、

TCR、粘附分子等第2页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三

Innateimmunity

固有免疫

定义：人类在种系进化过程中形成的、经遗传获得

的免疫，遇病原体后首先并迅速起防卫作 用的免疫应答组成：皮肤、粘膜及其产物、细胞（NK细胞、单

核-吞噬细胞、DC、NKT、中性粒细胞、T

细胞、B1细胞）等特点：先天具有、无潜伏期、无特异性、无记忆性作用时间：0-96小时第3页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三

Adaptiveimmunity

获得性(适应性)免疫

定义：机体在生活过程中，因接触抗原性物质而获

得的免疫。T、B细胞识别病原体成分后产 生的免疫应答特点：后天获得、有潜伏期、特异性，记忆性参与细胞：T细胞和

B细胞起作用时间：晚，一般在感染后4-5天发挥作用第4页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三一、免疫细胞的种类与特征第5页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三

免疫细胞的分类根据免疫细胞在免疫应答中的作用可分为三类免疫活性细胞(immunocompetentcells)抗原提呈细胞(antigen-presentingcells,APC)其他细胞凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，通称为免疫细胞（immunocyte），其中包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞DC、肥大细胞、粒细胞等第6页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三第7页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三

免疫细胞的起源与分化第8页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三免疫活性细胞具有特异性抗原受体、在接受抗原刺激下发生克隆性活化、增值和分化，产生适应性免疫应答（adaptiveimmuneresponse)的细胞。这类细胞是机体产生特异性免疫应答的基础，包括T细胞、B细胞第9页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三抗原提呈细胞

（antigenpresentingcell,APC）加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细胞、树突状细胞、B细胞第10页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三其他细胞自然杀伤(NK)细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等NK细胞肥大细胞嗜酸性粒细胞嗜中性粒细胞嗜碱性粒细胞血小板第11页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三免疫细胞的特征1、免疫细胞的形态学特征理化性状生物学特性第12页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三免疫细胞的特征2、免疫细胞的表面分子特征：白细胞分化抗原指血细胞分化成熟为不同谱系、分化的不同阶段以及细胞活化过程中,出现或消失的细胞表面标记分子聚类分化群(分化抗原，clusterofdifferentiation，CD)：应用单克隆抗体鉴定为主的方法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一分化抗原称为CD抗原CD抗原常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志第13页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三人CD分组分组

CD（举例）T细胞

CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD152(CTLA4)、

CD154(CD40L)、CD272(BTLA)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)B细胞

CD19、CD20、CD21、CD40、CD79a(Ig)、CD79b(Ig)、

CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、

CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)髓样细胞

CD14、CD35(CR1)、CD64(FcRI)、CD256(APRIL)、

CD257(BAFF)、CD312(EMR2)

血小板

CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v)、

CD61(整合蛋白3)、CD62P(P选凝素)NK细胞

CD16(FcRIII)、CD56(NCAM-1)、CD94、CD158(KIR)、

CD161(NKR-P1A)、CD314(NKG2D)、CD335(NKp46)、

CD336(NKp44)、CD337(NKp30)

非谱系

CD30、CD32(FcRII)、CD45RA、CD45RO、CD46(MCP)、

CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、CD279(PD1)、

CD281CD284(TLR1-TLR4)、CD289(TLR9)、CD305(LAIR-1)、

CD306(LAIR-2)、CD319(CRACC)第14页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三人CD分组分组

CD（举例）黏附分子

CD11a-CD11c、CD15、CD15s(sLx)、CD18(整合蛋白2)、

CD29(整合蛋白1)、CD49aCD49f、CD54(ICAM-1)、

CD62E(E整合蛋白)、CD62L(L整合蛋白)、CD324(E-cadherin)、

CD325(N-cadherin)、CD326(EpCAM)细胞因子/CD25(IL-2R)、CD95(Fas)、CD116-CDw137、CD178(FasL)、趋化因子受体

CD183(CXCR3)、CD184(CXCR4)、CD195(CCR5)、

CD261CD264(TRAIL-R1TRAIL-R4)内皮细胞

CD105(TGF-RIII)、CD106(VCAM-1)、CD140(PDGFR)、

CD144(VE钙黏蛋白)、CD299(DCSIGN-related)、

CD309(VEGFR2)、JAM1(CD321)、JAM2(CD322)碳水化合物结构

CD15u、CD60aCD60c、CD75、CDw327CDw329(siglec6、7、9)树突状细胞

CD85(ILT/LIR)、CD273(B7DC)、CD274CD276(B7H1-B7H3)、

CD302(DCL1)、CD303(BDCA2)、CD304(BDCA4)干细胞/祖细胞

CD133、CD243

基质细胞

CD292(BMPR1A)、CD293(BMPR1B)、

CD331CD334(FGFR1FGFR4)、CD339(Jagged-1)红细胞

CD233CD242

第15页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三二、免疫细胞的分离技术

（一）

外周血单个核细胞分离（二）

T淋巴细胞及其亚群的分离（三）

B淋巴细胞及其亚群的分离（四）

Mo/Mø分离技术

（五）NK细胞的分离技术

第16页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三免疫细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同第17页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法免疫细胞的分离技术1、密度梯度离心法2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法）3、磁性分离法4、荧光激活分离法5、其他分离法（花环沉降法）第18页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三（一）外周血单个核细胞分离

外周血单个核细胞（peripheralblood

mononuclearcells,PBMC）包括淋巴细胞和单核细

胞Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细

胞，是根据不同细胞密度不同的分离法第19页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三不同细胞密度不同

单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度

为1.077左右人的红细胞密度为1.093，>1.077

粒细胞密度为1.092，>1.077

血小板密度

<1.077

第20页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三肝素抗凝静脉血与等量Hank’s液或PBS混匀沿管壁缓慢叠加于Ficoll分层液面上水平离心2000rpm×20min

离心后管内分三层，用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞洗涤细胞两次RPMI1640重悬细胞台盼兰染液混合计数细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色活细胞数

活细胞百分率＝──────×100％

总细胞数

方法用本法分离PBMC，一般纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上第21页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三（二）T淋巴细胞及其亚群的分离第22页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三T淋巴细胞亚群T细胞的发育阶段分类表达TCR的类型分类是否表达CD4或CD8T细胞功能分类第23页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三T淋巴细胞亚群T细胞的发育阶段分类初始T细胞naiveTcells

未经抗原刺激的成熟T细胞，表达CD45RA效应T细胞

effectorTcells

表达高亲和力IL-2R，介导免疫效应记忆T细胞memoryTcells

表达CD45RO，介导再次免疫应答第24页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三T淋巴细胞亚群表达TCR的类型分类

TCRαβ+T细胞

TCRγδ+T细胞

第25页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三T淋巴细胞亚群是否表达CD4或CD8

CD4+T细胞

CD8+T细胞

第26页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三T淋巴细胞亚群T细胞功能分类

辅助性T细胞HelperTcells,Th

效应T细胞EffectorTcells,TE细胞毒T细胞CytotoxicTlymphocytes,CTL迟发性变态反应T细胞DelayedTcells，Td初始T细胞NaiveTcells

调节性T细胞RegulatoryTcells，Tr记忆T细胞MemoryTcells，Tm抑制性T细胞SuppressorTcells，Ts

第27页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三辅助性T细胞HelperTcells,Th

Th1:细胞免疫

Th2：体液免疫Th17：炎症反应第28页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三辅助性T细胞HelperTcells,ThTGF-+IL-6第29页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三辅助性T细胞HelperTcells,Th滤泡辅助性T细胞（T

follicular

helper，Tfh）通过细胞因子IL-10和IL-21来调节B细胞的功能

第30页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三

CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的分化Foxp+T调节细胞可以从胸腺直接分化，也可在TGF-作用下从Foxp3-T细胞分化。调节性T细胞RegulatoryTcells，Tr第31页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三玫瑰花结法（E花环沉降法）尼龙毛柱分离法淘洗法免疫磁珠法流式细胞术分选法（二）T淋巴细胞及其亚群的分离第32页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三人T淋巴细胞表面表达CD2分子，即绵羊红细胞受体，B细胞则无。在适当的条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结（rosette）,因为红细胞环绕T细胞，形似花环，所以又称E-花环（E-rosette）该实验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况

玫瑰花结法第33页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三淋巴细胞+SRBC悬液→37°C水浴10min→低温低速离心→T细胞形成E花环而沉于管底→悬液中为B细胞。方法

第34页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而T细胞不与尼龙毛粘附的特性，这是获得富含T细胞群的有效方法尼龙毛柱分离法第35页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三简单，快速，经济，尼龙毛可反复利用可分离大量细胞细胞不会被激活，可用于功能测定纯度不高耗时优点

缺点

第36页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三也叫亲合板结合分离法(immunepanningisolation）。利用亲合层析和抗体固相包被原理，将相应抗体结合于塑料平板上，由于各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的特点和表面标志，加细胞悬液后，凡抗原阳性的细胞则与相应的固相抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取同理若用特异性抗原交联于塑料板上，则可分离得到具有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细胞受体与特异抗原或抗体连接后有可能引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更合适

淘洗法第37页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三亲和板分离淋巴细胞示意图第38页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三利用T淋巴细胞表面某种标志性抗原与包被在固相载体上的特异性单抗结合，将T细胞与其他细胞分离的方法T淋巴细胞淘洗分离原理第39页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三羊抗兔Ig包被平皿

CD4一抗培育T细胞，倒入平皿，4℃孵育1小时；

收集未粘附的CD4-T细胞

PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞

收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微镜下观察方法

（以CD4+T细胞为例）第40页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离

免疫磁珠法

（Magneticactivatedcellsorting,MACS）第41页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三第42页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三NS阳性选择法（正选）

第43页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三NS阴性选择法（负选）

第44页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三第45页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三免疫磁珠细胞分选装置第46页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三第47页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三将特异性抗T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合T细胞在磁场中，结合T细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱T细胞免疫磁珠法阳性选择T细胞

第48页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三将多种特异性抗非T细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非T细胞在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的T细胞被洗脱下来免疫磁珠法阴性选择T细胞

第49页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三CD4+TCellIsolationKitIINon-CD4+TcellsinPBMC,i.e.,CD8+Tcells,γ/δTcells,Bcells,NKcells,dendriticcells,monocytes,granulocytes,anderythroidcells,areindirectlymagneticallylabeledbyusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodiesagainstCD8,TCRγ/δ,CD19,CD56,CD14,CD16,CD36,CD123,andCD235a(glycophorinA).ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti-BiotinMicroBeadsfordepletion.Thereby,highlypureCD4+Tcellsareobtained.免疫磁珠法阴性选择CD4+T细胞实例

PBMCbeforeseparationUntouchedCD4+Tcells第50页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三荧光激活细胞分离法

(fluorescenceactivatedcellsorter,FACS)第51页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三FACS用途：用流式细胞仪对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%第52页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三第53页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三方法

（以CD4+T细胞为例）PBMC用PBS洗涤，低温离心弃上清；加入含AB血清的PBS封闭，4℃孵育10分钟；加入适量的PerCP-CD3，APC-CD4抗体，4℃孵育30分钟；PBS洗涤，低温离心弃上清并用RPMI1640重悬；流式细胞术分选；第54页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三（三）B淋巴细胞及其亚群的分离如果仅考虑PBMC中T细胞和B细胞，那么所有从PBMC中分离T淋巴细胞的方法实际上也可用于分离B淋巴细胞。第55页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三B细胞表面标志

SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞

第56页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三终浓度5mML-leucinemethylester(L-LME)重悬PMBC，混匀，室温35s离心，400g，10min，弃上清，PBS洗涤细胞重悬于25mlRPMI1640培养基，过尼龙毛柱，去除细胞团块玫瑰花结法去除T细胞抗CD19或CD20单抗标记，流式细胞仪检验B细胞纯度去除Mo/Mø法

第57页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三将特异性抗B细胞表面分子CD19的单克隆抗体免疫磁珠与PBMC混合，用这种免疫磁珠从PBMC中结合B细胞在磁场中，结合B细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱CD19+B细胞

免疫磁珠法阳性选择B细胞

第58页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三将多种特异性抗非B细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非B细胞在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的B细胞被洗脱下来免疫磁珠法阴性选择B细胞

第59页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三BCellIsolationKitIINon-Bcells,i.e.,Tcells,NKcells,monocytes,dendriticcells,granulocytes,platelets,anderythroidcells,areindirectlymagneticallylabeledusingacocktailofbiotinylatedCD2,CD16,CD14,CD36,CD43,andCD235a(glycophorinA)antibodies.ThesecellsaresubsequentlymagneticallylabeledwithAnti-BiotinMicroBeadsfordepletion.HighlypureBcellsareobtainedbydepletionofmagneticallylabelednon-Bcells.PBMCbeforeseparationUntouchedBcells免疫磁珠法阴性选择B细胞实例

第60页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三（四）Mo/Mø分离技术单核-巨噬细胞包括骨髓中的前单核细胞、外周血中的单核细胞、以及组织内的巨噬细胞(Mφ)。Mφ来源于血液中的单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。第61页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三Mo/Mø细胞表面标志

表面标志抗原：CD14，但CD14也表达在粒细胞。CD14主要强表达在单核-巨噬细胞，弱表达在粒细胞上第62页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三

无血清RPMI1640培养液将PBMC2×106cell/ml重悬；75ml培养瓶中加入10

ml细胞悬液，于培养箱内37℃孵育1小时；吸尽培养液，RPMI1640培养液漂洗2遍，去除非黏附细胞；细胞刮片轻轻刮取黏附的单核细胞。黏附法第63页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三快速，方便纯度和得率均较低易引起Mo/Mø激活，引起基因表达和分泌蛋白优点

缺点

第64页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三将特异性抗单核细胞表面分子CD14的单克隆抗体免疫磁珠与PBMC混合，用这种免疫磁珠从PBMC中结合单核细胞在磁场中，结合单核细胞的免疫磁珠固定了，未结合的其它细胞被洗脱下来撤离磁场，再从免疫磁珠上洗脱CD14+单核细胞免疫磁珠法阳性选择单核细胞

第65页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三将多种特异性抗非单核细胞表面分子的单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠，用这种免疫磁珠从PBMC中结合非单核细胞在磁场中，结合其它细胞的免疫磁珠固定了，未结合的单核细胞被洗脱下来免疫磁珠法阴性选择单核细胞

第66页，讲稿共76页，2023年5月2日，星期三

MonocyteIsolationKitIINon-monocytes,suchasTcells,NKcells,Bcells,dendriticcells,andbasophils,areindirectlymagneticallylabeledusingacocktailofbiotin-conjugatedantibodiesagainstCD3,CD7,CD56,CD19,CD16,CD123,andCD235a(GlycophorinA),aswellasAnti-BiotinMicroBeads.Highlypureunlabeledmonocytesareobtainedbydepletionofthemagneticallylabeledcells.PBMCbeforesepar