分子生物学复习重点

名词解释RNAi：由一类小分子RNA介导基因沉默的机制称为RNA干扰（RNAi）信号转导：细胞通讯启动细胞内一系列化学反应，导致一组成分的活性、水平或亚细胞定位改变，最终引起细胞反应，包括改变代谢物浓度和代谢速度，最终导致细胞的生长、分裂、分化、衰老、死亡速度改变，这一过程称为信号转导。基因组：细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总和即为基因组启动子：是指基因序列中能被RNA聚合酶识别、结合、，从而形成转录起始复合物并启动转录的DNA序列，大多数位于基因（或操纵子）转录区的上游，具有方向性，属于调控元件。基因诊断：基因诊断属于分子诊断，是指直接检测基因组中致病基因或疾病相关基因的结构异常或表达水平的改变，或病原体基因的存在，从而对人体健康做出评价，或对人体疾病做出诊断。逆转录：逆转录又称反转录，是以RNA为模板，以dNTP为原料，在逆转录酶的催化下合成DNA的过程。这是一个从RNA向DNA传递遗传信息的过程，与从DNA向RNA传递遗传信息的转录过程相反，所以称为反转录。cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA全部经反转录形成的CDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。密码子：信使RNA链上（或DNA）决定一个氨基酸的相邻的三个碱基，亦称三联体密码。蛋白质组学：应用组学技术研究一定条件下的蛋白质组，包括组成、结构、性质、功能、分布、相互作用和条件变异等，建立和应用蛋白信息数据库。基因治疗：是指在基因水平上治疗疾病，包括基因添加、基因置换、基因修饰、基因干预、自杀基因治疗、免疫基因治疗等。简答题基因治疗方法和步骤基因治疗是指在基因水平上治疗疾病，包括基因添加、基因置换、基因修饰、基因干预、自杀基因治疗、免疫基因治疗等。基因治疗的方法主要包括(1)将正常基因导入病变细胞，表达产物参与细胞代谢。(2)将反义核酸导入病变细胞，抑制致病基因的过度表达。(3)将特定基因导入非病变细胞，表达特定产物，发挥治疗作用。基因治疗的一般步骤包括(1)选择和制备正常基因；(2)选择基因治疗的靶细胞；(3)将治疗性基因导入细胞；(4）转染细胞筛选和正常基因鉴定如何分别从DNA，mRNA和蛋白质水平上Knockdown基因的表达。提示：DNA水平可以从启动子着手，突变启动子或修饰启动子使其沉默，或者阻断与其结合的转录因子活性；RNA水平是采用RNA干扰实验最好；蛋白质水平是用抑制剂或抗体或负显性（Dominantnegative,也就是过表达某结构正常但没有活性蛋白，从而竞争性抑制内源正常蛋白）DNA水平上：（1）基因突变：DNA甲基化；基因重排，例如置于一个沉默子之中（2）影响转录：原核生物上，突变启动子或修饰启动子使其沉默；阻断σ因子与启动子结合或抑制其活性。真核生物上，阻断转录因子的活性，使RNA聚合酶无法转录基因，使基因表达受到抑制等等。（3）RNA生物合成抑制剂:碱基类似物，核苷类似物，模板干扰剂，RNA聚合酶抑制剂。RNA水平上：改变mRNA的稳定性，从而影响翻译效率；使5’非翻译区长度小于12nt，；翻译起始因子磷酸化利用RNA干扰技术，介导基因沉默：①miRNA与含有同源序列的mRNA结合，阻遏其翻译或促进其降解，产生基因沉默效应。②小干扰RNA能与目的基因mRNA结合，促进其降解，产生基因沉默效应。蛋白质水平上：（1）阻断或抑制蛋白质加工后的修饰；促进翻译阻遏蛋白（2）蛋白质生物合成抑制剂：直接抑制蛋白质合成的抗生素。（3）促进蛋白质泛素化，加快降解。（3）介导蛋白质的负显性：过表达某些结构正常但没有活性的蛋白，从而竞争性的一直内源正常蛋白。简述PCR引物设计原则。引物定位基因组DNA引物序列应定位于保守序列区域，且在其它区域没有同源序列（序列同源性一般不超过70%）；cDNA引物序列应尽量位于编码区内，断裂基因cDNA上游引物和下游引物应尽量定位于不同外显子内。引物长度控制在10~40nt，多数20~30nt。引物的末端3’端与模板严格互补，特别是末端的两个核苷酸，最好是S（即G或C）,但不能有连续的3个S。对大引物而言，5’端序列不必严格互补，甚至可以修饰。引物组成G和C含量应控制在40%~75%。引物序列引物之间不能存在互补序列，特别是3’端不能互补。引物内部不能存在可导致形成发夹结构的反向重复序列。引物所含单核苷酸重复序列长度不能超过5nt。引物熔点引物熔点Tm=2(A+T)+4(G+C)。引物熔点应该一致（相差不超过5℃）。根据被测定的对象，简述分子杂交印迹的种类及其特点、应用上优缺点。分为DNA印迹法和RNA印迹法。DNA印迹法还包括斑点印迹法、夹缝印迹法、菌落杂交法和噬菌斑杂交法。由此衍生的有蛋白质印迹法。、DNA印迹法，要先电泳后变性、转移。RNA印迹法为先变性后电泳、转移。2）、RNase（核糖核酸酶）无处不在，可以将RNA降解为核苷酸，因而从制备RNA到分析都要绝对消除外源RNase的污染，并尽量抑制内源性RNase。DNA印迹法则无此要求。3）、RNA印迹法不能采用碱变性，因为采用碱变性会导致RNA水解，所以只能采用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜等变性。（RNA印迹法可以用于定性或定量分析组织细胞内的总RNA或某一种特异RNA，特别是分析mRNA的长度和含量。）4）、斑点杂交法和夹缝杂交法的特点是用样量少、操作简便，提取的核酸不需要进行电泳和转移，但在同一张固定膜上可以点多个样本。5）、蛋白质印迹法也是由电泳分离、转移固定和检测分析等组成。只能用电转移法进行转移。用抗原-抗体反应检测目的蛋白.简答题克隆（筛选、测序、扩增、验证）疾病相关基因的方法。定位克隆的策略消减杂交的策略隆（筛选测序扩增验证）疾病相关基因的方法。筛选疾病相关基因（基因芯片，扣减杂交，蛋白质组学）①利用基因芯片筛选相关基因。基因芯片也称DNA芯片，基于核酸分子杂交，专以检基因聚合酶特点：重组DNA技术常用的10种工具酶1)限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA(2)DNA连接酶：(3)dna聚合酶Ⅰ：a.合成双链cDNA中第二条链;b.缺口平移制做探针;c.DNA序列分析;d.填补3′末端。(4)Taq酶：催化pcr反应，聚合DNA(5)反转录酶：a.合成cDNA;b.替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析(6)多聚核苷酸激酶：