质粒目的基因插入及引物设计流程

一.寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）质粒目的基因插入及引物设计流程质粒目的基因插入及引物设计流程质粒目的基因插入及引物设计流程质粒目的基因插入及引物设计流程质粒目的基因插入及引物设计流程质粒目的基因插入及引物设计流程1.选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基；2.注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长，则说明CDS序列稳定可用；质粒目的基因插入及引物设计流程将查到的CDS序列粘贴至newDNAfile框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该段序列中的可能酶切位点质粒目的基因插入及引物设计流程二.登录找到质粒的全序列质粒目的基因插入及引物设计流程同样将该质粒序列粘贴至软件中，比较目的基因和质粒的多克隆位点（即酶切位点）质粒目的基因插入及引物设计流程质粒目的基因插入及引物设计流程1.质粒选择酶切位点的原则：目的基因上不能存在将要使用的酶的酶切位点，否则目的基因会被切掉；2.质粒上选择酶切位点应该尽可能短，为将来其他可能的克隆预留位置，如本实验质粒选择Aflll和BamH1，目的基因上均不存在酶切位点，实验室也买了，可用：质粒目的基因插入及引物设计流程选中目的基因序列，复制质粒目的基因插入及引物设计流程在AflI后至BamHI前的序列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1质粒目的基因插入及引物设计流程质粒目的基因插入及引物设计流程在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HAtag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询：质粒目的基因插入及引物设计流程质粒目的基因插入及引物设计流程质粒目的基因插入及引物设计流程三.克隆引物设计1.电脑设计：回到NCBI的primerblast，拷贝目的基因CDS序列(共1602个碱基)，在框中输入>|a|和CDS序列，并在Min和Max分别输入1602（表示blastCDS全部基因）；质粒目的基因插入及引物设计流程2.手工设计：遵循GC尽量少，Tm尽量小的原则，5端后选20个左右；3端从酶切位点终点往前数59个，因为除去CDS框的20个碱基后还要包括HA位点和酶切位点序列。质粒目的基因插入及引物设计流程5端引物序列即为atggctgtggagtcccag，但是还要再加上一段保护碱基AAATATATCTTAAG最后可得Forwardprimer为AAATATATCTTAAGatggctgtggagtcccag质粒目的基因插入及引物设计流程tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct目的基因的20个碱基3端引物设计的起点（不含BamHI酶切位点）和方向质粒目的基因插入及引物设计流程最后要把引物顺序调整过来，点击“5→3”既得Reverseprimer序列tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct，同样在5端位置需再加上一段保护碱基AAATATATGGATCC最后Reverseprimer序列为AAATATATGGATCCtcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct质粒目的基因插入及引物设计流程构建表达载体的一般流程：设计primer(如上所述，综合考虑HA，CDS序列)→合成引物→选择合适的样本细胞（本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶，因此最好选择肝脏细胞系），提取mRNA并逆转录成cDNA→用设计的primer扩增目的基因（UGT1A1）→琼脂糖凝胶电泳→切胶回收特异条带→目的基因与质粒酶切结合，转染细菌扩大培养→提取质粒，测序判断