第二章生物菌种与扩大培养

一、工业生产常用的微生物1.细菌(bacteria)枯草芽孢杆菌-----生产淀粉酶与蛋白酶北京棒杆菌、钝齿棒杆菌----生产谷氨酸醋酸杆菌----生产醋酸嗜酸芽孢杆菌、产气杆菌----生产普鲁兰酶地衣芽孢杆菌---耐高温a-淀粉酶假单胞菌、短杆菌小球菌等----生产有机酸明串珠菌----生产聚葡萄糖、聚果糖、聚甘露糖苏云金杆菌-----生产杀虫剂细菌浸矿1本文档共88页；当前第1页；编辑于星期三\11点45分乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等的制作乳酸菌由糖类生成乳酸的一类细菌。以链球菌(Streptococcus)、四联球菌(Pediococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、乳杆菌(Lactobacillus)等属为重要，都是革兰氏阳性、不运动性及异养厌氧型。分两个亚族：链球菌亚属(Streptococeae)，其中有些菌种只产生乳酸，称为同型乳酸发酵；另一些菌种除生成乳酸外还生成醋酸、乙醇及二氧化碳，称为异型乳酸发酵(明川串株菌属)。乳杆菌亚属(Lactobacilleae)，其中的德氏乳杆菌(L.pasterianus)等菌株广泛用于乳制品工业和乳酸生产。2本文档共88页；当前第2页；编辑于星期三\11点45分芽孢杆菌

芽孢杆菌是高产淀粉酶和蛋白酶的产生菌，如枯草芽孢杆菌BF7658是生产淀粉酶的主要菌种，枯草芽孢杆菌AS1.398是生产中性蛋白酶和制造日本独特风味食品纳豆的主要菌种。它们还可用来生产多肽类抗生素、氨基酸、维生素B12及2，3-丁二醇、果胶酶等

枯草芽孢杆菌地衣芽孢杆菌3本文档共88页；当前第3页；编辑于星期三\11点45分食品纳豆4本文档共88页；当前第4页；编辑于星期三\11点45分梭状芽孢杆菌梭状芽孢杆菌是土壤中生芽孢的厌氧杆菌，用来由淀粉或糖发酵生产丁二醇、丙酮、丁醇、乙醇、某些有机酸及核黄素等。人们还利用耐热梭状芽孢杆菌和热解糖梭菌从纤维素和半纤维素生产酒精。

5本文档共88页；当前第5页；编辑于星期三\11点45分钝齿棒杆菌AS1.542的应用：能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、水杨苷、七叶灵以及乙酸、柠檬酸、乳酸、葡萄糖酸、延明羧酸等多种有机酸作为碳源迅速进行谷氨酸发酵，不分解淀粉、纤维素、油酯和明胶。铵盐和尿素均可作为氮源，能还原硝酸盐，不同化酪蛋白。要求多种无机离子，需要生物素作为生长因素。好氧或兼性厌氧，过氧化氢酶反应阳性。20～37℃生长良好，39℃生长微弱，最适生长温度30℃。pH6～9生长良好，pH10生长减弱，pH4～5不生长。在含7.5%NaCl或2.5%尿素肉汁培养基中生长良好，10%NaCl和3%尿素生长受到抑制。不受北京棒杆菌1.299的噬菌体侵染。产氨短杆菌它是氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。

谷氨酸棒杆菌6本文档共88页；当前第6页；编辑于星期三\11点45分甲烷产生菌主要是甲烷杆菌(Methanobacterium)、甲烷八叠球菌(Methanosarcina)、甲烷球菌(Methanococcus)，这些甲烷菌在有机废料甲烷发酵中起重要作用。枯草芽孢杆菌-----生产淀粉酶与蛋白酶北京棒杆菌、钝齿棒杆菌----生产谷氨酸醋酸杆菌----生产醋酸嗜酸芽孢杆菌、产气杆菌----生产普鲁兰酶地衣芽孢杆菌---耐高温a-淀粉酶假单胞菌、短杆菌小球菌等----生产有机酸明串珠菌----生产聚葡萄糖、聚果糖、聚甘露糖苏云金杆菌-----生产杀虫剂7本文档共88页；当前第7页；编辑于星期三\11点45分醋酸菌醋酸菌不生芽孢、革兰氏阴性，好氧，分两个菌群。一个菌群只将乙醇氧化生成醋酸，醋酸是最终产品，同时它也能将葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，一般称之为醋单胞菌(Acetomonas)或葡萄糖杆菌(Gluconobacter)。另一群醋酸菌不仅能将乙醇氧化为醋酸，而且能将产生的醋酸进一步氧化生成二氧化碳和水，这一类菌就叫醋酸杆菌。8本文档共88页；当前第8页；编辑于星期三\11点45分醋酸菌的应用：主要醋酸菌种有：

（1）纹膜醋酸杆菌（A.aceti）:培养时液面形成乳白色、皱褶状的粘性菌膜。摇动时，液体变混。能产生葡萄糖酸，最高产醋酸量8.75%。最适生长温度30℃，能耐14%～15%的酒精。

（2）奥尔兰醋酸杆菌（A.orleanense）:属纹膜醋酸杆菌的亚种，也是法国奥尔兰地区用葡萄酒生产食醋的菌种。最高产醋酸量2.9%，耐酸能力强，能产生少量的酯。最适生长温度30℃。

（3）许氏醋杆菌（A.Schutzenbachii）：它是法国著名的速酿食醋菌种，也是目前酿醋工业重要的菌种之一。最高产醋酸量达11.5%。对醋酸没有进一步的氧化作用，耐酸能力较弱。最高生长温度37℃。

（4）醋酸杆菌AS1.41：是我国酿醋工业常用菌种之一。产醋酸量6%～8%，可将醋酸进一步氧化为CO2和H2O。最适生长温度28～30℃，耐酒精浓度8%。

9本文档共88页；当前第9页；编辑于星期三\11点45分双歧杆菌属：代表种：人体肠道中共有8种，其中数量最多的5种为：

两歧双歧杆菌（B.bifidum）、

婴儿双歧杆菌（B.infantis）、

青春双歧杆菌（B.adolescentis）、

长双歧杆菌（B.longum）、

短双歧杆菌(B.breve)。

双歧杆菌是人体肠道有益菌群，它可定殖在宿主的肠粘膜上形成生物学屏障，具有拮抗致病菌、改善微生态平衡、合成多种微生素、提供营养、抗肿瘤、降低内毒素、提高免疫力、保护造血器官、降低胆固醇水平等重要生理功能，其促进人体健康的有益作用，远远超过其它乳酸菌。10本文档共88页；当前第10页；编辑于星期三\11点45分大肠杆菌以埃希氏大肠杆菌(Escherichiacoli)、产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)等为代表。工业上利用大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶，进行谷氨酸定量分析，还可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。医药方面用大肠杆菌制造治疗白血症的天冬酰氨酶。大肠杆菌经常用作分子生物学的研究材料，同时和病原菌有很密切的关系。

11本文档共88页；当前第11页；编辑于星期三\11点45分2、酵母菌(yeast)

酵母菌为单细胞真核生物，主要分布在含糖较多的酸性环境中（果皮、发酵果汁、土壤和酒曲中）--研究最彻底。

工业上用的酵母菌有啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。分别用于酿酒、制造面包、生产石油，蛋白、脂肪酶等。12本文档共88页；当前第12页；编辑于星期三\11点45分（1）啤酒酵母的应用：能发酵葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖和麦芽三糖以及1/3的棉子糖，不发酵蜜二糖、乳糖和甘油醛，也不发酵淀粉、纤维素等多糖。不分解蛋白质，可同化氨基酸和氨态氮，不同化硝酸盐。需要B族维生素和P、S、Ca、Mg、K、Fe等无机元素。兼性厌氧，有氧条件下，将可发酵性糖类通过有氧呼吸作用彻底氧化为CO2和H2O，释放大量能量供细胞生长；无氧条件下，使可发性糖类通过发酵作用（EMP途径）生成酒精和CO2，释放较少能量供细胞生长。最适生长温度25℃，发酵最适温度10-25℃。最适发酵pH为。真正发酵度达60%-65%。

13本文档共88页；当前第13页；编辑于星期三\11点45分啤酒酵母14本文档共88页；当前第14页；编辑于星期三\11点45分（2）葡萄酒酵母的应用：

葡萄酒酵母的培养特征

葡萄汁固体培养，菌落呈乳黄色，不透明，有光泽，表面光滑湿润，边缘整齐；随培养时间延长，菌落颜色变暗。

液体培养变浊，表面形成泡沫，聚凝性较强，培养后期菌体沉降于容器底部。

可发酵葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖以及1/3的棉子糖，不发酵蜜二糖、乳糖和甘油醛，也不发酵淀粉、纤维素等多糖。

不分解蛋白质，不还原硝酸盐，可同化氨基酸和氨态氮。需要B族维生素和P、S、Ca、Mg、K、Fe等无机元素。

兼性厌氧，有氧条件下，将可发性糖类通过有氧呼吸作用彻底氧化为CO2和H2O，释放大量能量供菌体繁殖；

无氧条件下，使可发酵性糖类通过发酵作用（EMP途径）生成酒精和CO2，释放较少能量供细胞繁殖。

最适生长温度25℃，葡萄酒发酵最适温度15-25℃。最适发酵pH为。耐酸、耐乙醇、耐高渗、耐二氧化硫能力强于啤酒酵母。葡萄酒发酵后乙醇含量达16%以上。15本文档共88页；当前第15页；编辑于星期三\11点45分（3）产蛋白假丝酵母的应用：能发酵葡萄糖、蔗糖和1/3的棉子糖，不发酵半乳糖、麦芽糖、乳糖、蜜二糖。能同化尿素、铵盐和硝酸盐，不分解蛋白质和脂肪。

兼性厌氧，有氧条件下，进行有氧呼吸；无氧条件下，进行酒精发酵。

最适生长温度25℃，最适生长pH为4.5～6.5。

在发酵工业中，常采用富含半纤维的纸浆废液、稻草、稻壳、玉米芯、木屑、啤酒废渣等水解液和糖蜜为主要原料，培养产蛋白假丝酵母，生产食用或饲用单细胞蛋白和维生素B。16本文档共88页；当前第16页；编辑于星期三\11点45分3、霉菌(mould)霉菌不是分类学上的名词，是丝状真菌的一个通俗名称，凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状or絮状菌丝的真菌统称为霉菌，有较强陆生性，它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性，繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，但多以无性孢子繁殖为主，其生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状。工业上常用的霉菌有藻状菌纲的的根霉、青霉、曲霉、毛霉等17本文档共88页；当前第17页；编辑于星期三\11点45分3.1根霉属（Rhizopus）

根霉与毛霉类似，能产生大量的淀粉酶，故用作酿酒、制醋业的糖化菌。有些种根霉还用于甾体激素、延胡索酸和酶剂制生产。

根霉的生物学特性

根霉与毛霉相似，菌丝为无隔单细胞，生长迅速，有发达的菌丝体，气生菌丝白色、蓬松，如棉絮状。

根霉气生性强，故大部分菌丝葡匐生长在营养基质的表面。这种气生菌丝，称为葡匐菌丝。基内菌丝根状称为假根。由假根着生处，向上长出直立的2~4根孢囊梗，孢囊梗不分枝，梗的顶端膨大形成孢囊，同时产生横隔，囊内形成大量孢囊孢子。

根霉的有性生殖产生接合孢子。除有性根霉为同宗结合外，其它根霉都是异宗结合。

常见的根霉：

18本文档共88页；当前第18页；编辑于星期三\11点45分（1）．米根霉（Rhizopusoryzae）这个种在我国酒药和酒曲中常看到，在土壤、空气，以及其它各种物质中亦常见。菌落疏松，初期白色，后变为灰褐色到黑褐色，匍匐枝爬行，无色。假根发达，指状或根状分枝，褐色，孢囊梗直立或稍弯曲，2~4根，群生。尚未发现其形成接合孢子，发育温度30~35℃，最适温度37℃，41℃亦能生长。此菌有淀粉酶、转化酶，能产生乳酸、反丁烯二酸及微量的酒精。产L（+）乳酸量最强，达70%左右。是腐乳发酵的主要菌种。

（2）．华根霉（Rhizopuschinensis

）此菌多出现在我国酒药和药曲中，这个种耐高温，于45℃能生长，菌落疏松或稠密，初期白色，后变为褐色或黑色，假根不发达，短小，手指状。孢子囊柄通常直立，光滑，浅褐色至黄褐色。不生接合孢子，但生多数的厚垣孢子，发育温度为15~45℃，最适温度为30℃。此菌淀粉液化力强，有溶胶性，能产生酒精、芳香脂类、左旋乳酸及反丁烯二酸，能转化甾族化合物。

19本文档共88页；当前第19页；编辑于星期三\11点45分根霉种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉应用：酿酒20本文档共88页；当前第20页；编辑于星期三\11点45分3.2毛霉属（Mucor）

毛霉的生物学特性

菌落形态：菌落絮状，初为白色或灰白色，后变为灰褐色菌丛高度可由几毫米至十几厘米，有的具有光泽。

菌丝形态：菌丝无隔。分气生、基生；后者在基质中较均匀分布，吸收营养；

气生菌丝发育到一定阶段，即产生垂直向上的孢囊梗；梗顶端膨大形成孢子囊，囊成熟后，囊壁破裂释放出孢囊孢子；囊轴呈椭园形或圆柱形；孢囊孢子为球形、椭圆形或其他形状，单细胞、无色，壁薄而光滑，无色或黄色；有性孢子（接合孢子）为球形，黄褐色，有的有突起。

21本文档共88页；当前第21页；编辑于星期三\11点45分常见的毛霉菌种

（1）．高大毛霉（Mucormucedo

）在培养基上的菌落，初期为白色，随培养时间的延长，逐渐变为淡黄色，有光泽，菌丝高达3~12cm或更高。孢子囊柄直立不分枝。孢子囊壁有草酸钙结晶，此菌能产生3-羟基丁酮、脂肪酶。

（2）．总状毛霉（Mucorracemosus）是毛霉中分布最广的一种。菌丝灰白色，菌丝直立而稍短，孢子囊柄总状分枝。我国四川的豆豉即用此菌制成。另外总状毛霉能产生3-羟基丁酮，并对甾族化合物有转化作用。

（3）．鲁氏毛霉（MucorRouxianus)此菌种最初是从我国小曲中分离出来的，菌落在马铃薯培养基上呈黄色，在米饭上略带红色，孢子囊柄呈假轴状分枝，厚垣孢子数量很多，大小不一，黄色至褐色，接合孢子未见。鲁氏毛霉能产生蛋白酶，有分解大豆的能力，我国多用它来做豆腐乳。

22本文档共88页；当前第22页；编辑于星期三\11点45分3.3曲霉属（Aspergilus）

本属菌丝有隔，多细胞。菌落呈圆形。以分生孢子方式进行无性繁殖，本属分生孢子呈绿、黄、橙、褐、黑等各种颜色，故菌落颜色多种多样，而且比较稳定，是分类的主要特征之一。曲霉菌的有性世代产生闭囊壳，其中着生圆球状子囊，囊内含有8个子囊孢子。子囊孢子大都无色，有的菌种呈红、褐、紫等颜色。

23本文档共88页；当前第23页；编辑于星期三\11点45分常见的曲霉菌（续）应用：生产有机酸、生产淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶24本文档共88页；当前第24页；编辑于星期三\11点45分常见的曲霉菌

（1）．米曲霉(Asp.oryzae）米曲霉菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，老后大多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。25本文档共88页；当前第25页；编辑于星期三\11点45分(2).黄曲霉（Asp.flavus）该菌为中温性、中生性霉菌。生长温度为6~47℃，最适温度为30~38℃；生长的最低水活度为0.8~0.86。分布很广泛，在名类食品和粮食上均能出现。有些种产生黄曲霉毒素，使食品和粮食污染带毒，黄曲霉毒素毒性很强，有致癌致畸作用。该菌产毒的最适温度为27℃；最适水活度为0.86以上。有些菌株具有很强的糖化淀粉，分解蛋白质的能力，因而被广泛用于白酒、酱油和酱的生产。

菌落：生长快，柔毛状，平坦或有放射状沟纹；初为黄色，后变为黄绿或褐绿色；反面无色或略带褐色。有的菌株产生灰褐色的菌核。

菌体：分生孢子梗壁粗糙或有刺，无色；分生孢子头为半球形、柱形或扁球形；小梗一层或两层，在同一顶囊上有时单、双层并存；顶囊近球形或烧瓶状；分生孢子球形，表面光滑或粗糙。

26本文档共88页；当前第26页；编辑于星期三\11点45分(3)．黑曲霉（Asp.niger）该群是接近高温性的霉菌，生长适温为35~37℃，最高可达50℃；孢子萌发的水活度为0.80~0.88，是自然界中常见的霉腐菌。

菌落：菌丝密集，初为白色，扩散生长，培养时间延长，菌丝变为褐色，分生孢子形成后由中央变黑，逐步向四周扩散。有的有放射状沟纹；背面无色或黄褐色。

菌体：分生孢子梗壁厚，光滑，分生孢子头球形，放射状或裂成几个放射的柱状，黑色或褐色，分生孢子球形；菌丝有横隔；

该菌具有多种活性强大的酶系，可用于工业生产。如淀粉酶用于淀粉的液化、糖化以生产酒精、白酒或制造葡萄糖和糖化剂；酸性蛋白酶用于蛋白质的分解或食品消化剂的制造及皮毛软化；果胶酶用于水解聚半乳糖醛酸、果汁澄清和植物纤维精炼。

27本文档共88页；当前第27页；编辑于星期三\11点45分3.4青霉属（Penicillium）生物学特性

菌落：菌落圆形，扩展生长；表面平坦或有放射状沟纹或有环状轮纹；有的有较深的皱褶，使菌落呈纽扣状；有的表面有各种颜色的渗出液，具有霉味或其他气味；四周常有明显的淡色边缘；菌落正面有青绿、蓝绿色、黄绿色、灰绿色。菌丝有隔，分气生、基生。大部分青霉菌只有无性世代，产生分生孢子，个别有性世代，产生子囊孢子。进行无性繁殖时，在菌丝上向上长出芽突，单生直立或密集成束，即为分生孢子梗。分生孢子梗向上长到一定程度，顶端分枝，每个分枝的顶端又继续生出一轮次生分枝称梗基；在每个梗基的顶端，产生一轮瓶状小梗；每个小梗的顶端产生成串的分生孢子链。分枝、梗基、小梗构成帚状分枝；帚状分枝与分生孢子链构成帚状穗（青霉穗）；分生孢子球形、卵形或椭圆形，光滑或粗糙。28本文档共88页；当前第28页；编辑于星期三\11点45分29本文档共88页；当前第29页；编辑于星期三\11点45分常见的青霉菌

1．桔青霉（Pen.citrinum）该菌属于不对称组，绒状亚组，桔青霉系。一般大米产区都有此菌发生。危害大米使其黄变（泰国黄变米），有毒，其霉素是桔青霉素。该菌生长适温为25~30℃，最高发育温度为37℃；生长的最低水活度为0.80~0.85。

菌落：生长局限，10~14d直径2~2.5cm；有放射状沟纹；绒状，有的稍带絮状；艾绿色到黄绿色；有窄白边；渗出液淡黄色；反面黄色至褐色。

菌体：帚状枝典型的双轮生，不对称；分生孢子梗多数由基质长出，壁光滑，带黄色，长50~200μm；梗基2~6个，轮生于分生孢子梗上，明显散开，端部膨大；小梗6~10个，密集而平行，基部圆瓶形；分生孢子链为分散的柱状；分生孢子球形或近球形，2.2~3.2μm，光滑或接近光滑。

2．展开青霉（Pen.expanasum）作为苹果的腐败菌被分离到的。

菌落：菌落生长迅速，黄绿色—青绿色，束状，背面无色——黄褐色。分生孢子梗长200~300μm，平滑，梗径10~15μm，分生孢子小梗单轮生，分生孢子椭圆形或球形，2.3×1μm。

30本文档共88页；当前第30页；编辑于星期三\11点45分4.放线菌（actinomycetes）因菌落呈放线状而得名，基本上是与细菌类同的原核细胞生物，无典型的核和核结构，对青霉素、四环素、磺胺等抗菌素敏感。放线菌大部分是链丝菌or链霉菌，大多为腐生菌，少数为寄生菌，主要存在于有机物丰富的微碱土壤中，空气、淡水、海水中也存在，土壤中特有的泥腥味主要是放线菌所产生的代谢产物引起。放线菌的突出特性之一是产生抗菌素。到目前为止临床和农业上使用的抗菌素大多数是利用放线菌生产的。如链霉素、土霉素、卡那霉素、庆大霉素等。31本文档共88页；当前第31页；编辑于星期三\11点45分其他霉菌粗糙链孢霉：微生物遗传学的重要研究材料，好食链孢霉的孢子色素中含有多量的β-胡萝卜素，是维生素A的研究材料。阿舒氏假囊霉和棉病假囊霉：都是植物病原菌。前者雌雄异株，后者雌雄同体，但互为近缘菌种，通常为维生素B2产生菌。白地霉：其菌体蛋白营养价值很高，可供食用及饲用，也可提取核酸，还可合成脂肪，在糖厂、酒厂、淀粉厂、饮料厂、豆腐厂、制药厂等的废料和废水综合利用方面很有前途。32本文档共88页；当前第32页；编辑于星期三\11点45分白地霉

粗糙链孢霉33本文档共88页；当前第33页；编辑于星期三\11点45分种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素34本文档共88页；当前第34页；编辑于星期三\11点45分5.担子菌（basidiomycetes）

就是人们通常所说的菇类微生物。银耳、木耳目等

6.藻类（alga）

自然界分布极广的一类自养微生物资源，人们用它作为人类保健食品和饲料。培养藻类获得廉价高质的蛋白质：培养螺旋藻，1公顷面积可获得60吨（干重）的螺旋藻，从蛋白质产率来看是大豆的28倍。

可通过培养藻类利用二氧化碳转化成生物柴油，如单胞藻（1公顷面积可获得60吨石油燃料）

35本文档共88页；当前第35页；编辑于星期三\11点45分螺旋藻36本文档共88页；当前第36页；编辑于星期三\11点45分未培养微生物：指迄今为止所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得的纯培养的微生物。极端微生物，又称嗜极菌。研究方法主要有：模拟自然培养法；宏基因组分析法。南极冰下湖存在着复杂的微生物群

宏基因组是基因组学一个新兴的科学研究方向。宏基因组学（又称元基因组学，环境基因组学，生态基因组学等），是研究直接从环境样本中提取的基因组遗传物质的学科。传统的微生物研究依赖于实验室培养，元基因组的兴起填补了无法在传统实验室中培养的微生物研究的空白。37本文档共88页；当前第37页；编辑于星期三\11点45分嗜热微生物：《自然》杂志曾报道在流体静压为250个标准大气压，水温高达250℃-300℃的热液口水域里发现有细菌存活。极端高温微生物一般生活在热水系统周围、制糖厂一带、青贮饲料堆和堆肥里，或位于海底断陷谷中的热液口中。“PCR”(聚合酶链式反应),其中的DNA聚合酶就是从一种嗜热微生物中提取分离出来的，这种酶在90℃以上的高温下仍可继续工作。

嗜寒微生物：

有些细菌在0℃以下仍可正常生长，当温度超过20℃时反而会死亡。38本文档共88页；当前第38页；编辑于星期三\11点45分嗜酸微生物：硫杆菌是一类能产生硫酸的杆菌，因此这一类细菌能在pH5~2之间的环境中滋生繁殖。还有一类细菌叫做铁杆菌，能够分解黄铁矿而使其中部分硫转变为硫酸，因此它们的最适pH也非常低。它们生存的环境也很特殊，如硫磺泉、硫矿、黄铁矿，或金、铜、铅或铀矿矿口的废物堆中。硫杆菌细胞内的pH值在6~7之间，这就意味着硫杆菌细胞内外的氢离子数量相差上万倍。嗜碱微生物：嗜碱菌必须在pH8以上的环境里才能存活，而它们最佳生存环境的pH值高于10，许多能在pH11.5的环境中存活，最高存活记录达pH13。从嗜碱菌细胞中提取的许多酶不仅具有抗破坏能力，而且只有在碱水里才最为活跃，这也使得嗜碱菌具有重要的商业价值。一般肥皂都是碱性的，嗜碱菌的细胞酶则能够作为添加剂用于肥皂的生产。39本文档共88页；当前第39页；编辑于星期三\11点45分嗜盐微生物：嗜盐微生物能够在高浓度盐溶液中正常生长，如盐杆菌，它们的生存环境不可缺少盐，在含18%氯化钠的溶液里生长最旺盛，在盐量饱和的溶液和潮湿的盐粒上也能滋生繁衍。还有一种“浮游水藻”，其组织非常简单，以其抗盐性强而著称，可以在含盐量高达33%的饱和溶液里生存，而在正常的水中无法生存。压强极端微生物：在海底的一些嗜热微生物就属于强压微生物，它们可以承受巨大的压强（大洋最深处的流体静压可高达1100个大气压）。经实验证实，大肠杆菌在被提供合适养料的情况下，可以在300个大气压下生长。

40本文档共88页；当前第40页；编辑于星期三\11点45分二、微生物工业对菌种的要求

微生物资源丰富，广布于土壤、水和空气等自然界中，其中土壤中最多。现在微生物工业用菌有的是野生型，有的是通过诱变得到的突变体。发展趋势：从野生型变异株自然选育代谢控制育种诱变育种基因工程定向育种41本文档共88页；当前第41页；编辑于星期三\11点45分微生物工业对大规模生产用菌的要求原则：（1）所需培养基易得，价格低廉；（2）培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）（3）生长速度和反应速度较快，发酵周期短（4）单产高（选择野生型、营养缺陷型或调节突变株）（5）抗病毒能力强（6）菌种纯粹，不易变异退化，稳定性好（7）菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保证安全42本文档共88页；当前第42页；编辑于星期三\11点45分第二节工业微生物菌种的退化、复壮与保藏一、菌种的退化、复壮1.1菌种退化的原因生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失称为菌种退化。菌种退化可以是形态上的，也可以是生理上的。菌种退化表现：（1）产量降低，出现负增长；（2）生长速度缓慢，产孢子越来越少；（3）代谢产物生产能力或其对宿主的寄生能力下降；（4）抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱。43本文档共88页；当前第43页；编辑于星期三\11点45分菌种退化的原因：1.基因突变菌种退化的主要原因就是那些控制生产性状的基因发生负突变。在生物进化过程中，遗传变异是绝对的，而它的稳定性是相对的；退化性变异是大量存在的，而进化性变异是个别的。从生物学角度讲，生产实践中采用的优良菌株往往是不正常的，许多都是营养缺陷型，一旦发生回复突变，成为野生型。随着传代次数增加，回复突变菌株会在数量上占优势。2.分离现象遗传育种获得的菌种若是DNA双链之一发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。这种退化不是基因突变引起的，而是由于诱变获得的高产菌本身不纯。高产菌只发生在一条DNA单链上，随着细胞分裂，突变基因与未突变基因发生分离，出现突变的高产菌株和未突变的低产菌株。44本文档共88页；当前第44页；编辑于星期三\11点45分菌种退化的原因（续）3.连续移代微生物自发突变都是通过繁殖传代出现的。DNA在复制过程中，自发突变率为10－8～10－9，移代次数越多，发生突变的概率越高。突变后的菌株随着传代次数的增加会在数量上逐渐占优势，最终整个菌群出现退化。4.培养和保藏条件的影响不良的营养条件如营养成分、温度湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发低产基因型菌株的出现，而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量发生对比，造成整个菌群出现退化。45本文档共88页；当前第45页；编辑于星期三\11点45分1.2菌种退化的防止

（1）菌种的分离；

（2）菌种的复壮；

（3）提供良好的环境条件；

（4）用优良的保藏方法；

（5）定期纯化菌种。46本文档共88页；当前第46页；编辑于星期三\11点45分1.3菌种的复壮

“狭义”复壮：是一种消极措施，指在菌种已经发生退化的情况下，通过纯化分离和测定生产性能等方法，从退化的群体中找出尚未衰退的个体，进一步繁殖，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。

“广义”复壮：是一种积极措施，指在菌种还未发生退化前就有意识地进行纯种分离与生产性能鉴定，以保持菌种稳定的生产性状，甚至使其逐步有所提高。47本文档共88页；当前第47页；编辑于星期三\11点45分菌种复壮的方法：

（1）纯种分离

通过纯种分离，可以把退化菌种的细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来。一般分为菌落纯（通过平板划线、平板涂布、培养基稀释法获取单菌落）；细胞纯（用“分离小室”、显微镜操纵、菌丝尖端切割法进行单细胞分离）

（2）淘汰法

淘汰已经衰退的个体。

（3）宿主体内复壮法

对于寄生性的微生物退化菌株，可以通过接种至相应的昆虫等动植物宿主体内的措施来提高它们的活性。48本文档共88页；当前第48页；编辑于星期三\11点45分1.4菌种保藏

菌种的保藏方法有很多，但其基本原理是大同小异的，主要是根据微生物生理、生化特点，人工地创造条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。

（1）目的：提高菌种存活率，减少菌种的变异，保持原来优良的生产性能。

（2）原理：根据菌种的生物生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态。

保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。49本文档共88页；当前第49页；编辑于星期三\11点45分（3）菌种保藏的方法：

A.斜面保藏法

这是一种最基本的方法，适用范围广，细菌、真菌和放线菌都可应用。当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后，一般在5℃左右可保藏3-6个月，到期后重新移种一次。保藏温度和时间都不是绝对的，个别菌种甚至在37℃保藏为宜，也有的需要l～2周传代一次。

这种保藏方法的弊端在于传代多了容易发生变异，同时污染机会也增加。

B.干燥保藏法

这种方法是将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。

一般将园土或耕作土研细、过筛(24筛目)，干燥后使用，也可以用砂子筛后以氢氧化钠和盐酸交替洗涤净后作为载体。土壤或沙子12l℃高压灭菌2—3次。试管口可熔封亦可用石蜡封口后，放在干燥器内在5℃保藏，其保藏期一般为两年，有些微生物可长达10年之久。适用的微生物不多，存活期亦较短。50本文档共88页；当前第50页；编辑于星期三\11点45分（3）菌种保藏的方法(续)：C.悬液保藏法是将微生物悬浮于不含养分的溶液中，如蒸馏水、0．25mol/L磷酸缓冲液（pH6．5）或生理盐水中。大部分能保藏一年或更长。此法的关键是要用密封性能好的螺旋口试管或一般试管加橡皮塞以防止水分的蒸发。保藏在10℃或室温(18～20℃)更优于低温操作。D.冷冻保藏法保藏期长、变异小、便于大量保藏及适用范围广等优点，是各保藏机构使用的主要方法。其基本原理是将微生物或袍子冷冻，然后在减压情况下利用升华现象除去水分，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下进行长期保藏。51本文档共88页；当前第51页；编辑于星期三\11点45分（3）菌种保藏的方法(续)：E.液氮保藏法效果好、方法简单、保藏的对象也最为广泛。其方法是将浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，细菌加入最终浓度为10％的甘油或5％二甲基亚砜(DMSO)作为防冻的保护剂。安瓴管开始以每分钟l℃的缓慢速度冷却至—25℃左右，有的菌种要经过干冰—乙二醇等制冷剂冷却至—78℃再故人液氮罐中。安瓴管保藏在—196℃的液氮中，亦可在—150℃的液氮中。从液氮中取出安额管应当放入38℃—40℃的温水中振荡1—2min使之完全融化，这样做有利于细胞的复苏。这种方法的保藏期一般为两三年，长的可达九年。该方法的缺点是不能发送菌种。52本文档共88页；当前第52页；编辑于星期三\11点45分（3）菌种保藏的方法(续)：F.低温保藏法大多数的微生物可在—20℃以下的低温中保藏。使用密封性能好的螺旋口小管，加入1—2ml的菌液，直接放入低温冰箱中保藏。一般是温度低时保藏效果好；悬液的浓度应用浓度高的为宜，但是因微生物不同而异。该法的保藏期约在一年左右。53本文档共88页；当前第53页；编辑于星期三\11点45分保藏菌种的技术要点:

（1）选择适宜的培养基、培养温度和菌龄，以便得到健壮的细胞或孢子

（2）保存在低温、隔氧、干燥、避光的环境中，使微生物尽量降低或停止代谢活动，减慢或停止生长繁殖

（3）不污染杂菌

（4）在较长时间内保持生命活力和相对遗传稳定性。54本文档共88页；当前第54页；编辑于星期三\11点45分冷冻干燥方法的适用范围适用于大多数的细菌、放线菌、病毒、霉菌、酵母菌等不适用于真菌的营养体细胞结构与功能的相对统一是成功进行冷冻干燥保存的基础。55本文档共88页；当前第55页；编辑于星期三\11点45分冷冻干燥的生理性损伤冷冻干燥对微生物细胞的生理损伤和致死是客观存在的。生理损伤和致死之间的关系复杂，很难截然将其分开。生理损伤不易被发现，以“隐性损伤”的形式存在于细胞中。有时，细胞的隐性损伤会在生理、代谢、遗传等方面对生物体造成不利影响，致使生物体发生突变。多数情况下，冷冻干燥对微生物细胞造成的生理损伤是暂时的，属非致死损伤，以隐性损伤长期存在的例子仍为少数。冷冻干燥后恢复生长的条件影响冻干效果。通过提供合适的营养物、极佳的培养条件，多数生理损伤可在短期内恢复。56本文档共88页；当前第56页；编辑于星期三\11点45分冻干导致细胞致死损伤的机理微生物在冻干过程中的致死损伤是不可避免的。完善冻干程序、优化冻干条件，加入冻干保护剂只能是减少致死损伤。冷冻对微生物细胞的致死损伤

预冻对微生物细胞冻干效果至关重要，有效的预冻条件能减少细胞的损伤，有利于冻干过程中水分的升华。预冻产生的致死损伤，尚无统一的理论，一般认为主要是机械效应和溶质效应引起。干燥对微生物细胞的致死损伤

可能是缺水引发的生理损伤，尤其对于不耐干燥的微生物。很大程度是由于干燥引起膜脂的性质、结构、功能的改变使膜的流动性或完整性改变，膜的功能失调，导致细胞死亡。57本文档共88页；当前第57页；编辑于星期三\11点45分保护剂系统的保护效应避免微生物细胞因脱水造成的危害脱水使细胞膜结构发生相变（液晶态脂膜变成凝胶态），从而导致细胞死亡。冻干保护剂，尤其是糖类保护剂，通过水置换作用，抑制脂膜的相变，使保护剂存在下的干燥脂膜和无保护剂存在时的水合脂膜的生理特性相似。保护微生物细胞膜系统的完整性

保护剂的水置换作用、保护剂中的脂蛋白与膜脂蛋白的结构相同（β折叠结构）、增加粘度，稳定渗透压。保护微生物细胞代谢酶的生物活性

保护剂系统不同程度地消除了干燥对酶活性的影响，使微生物细胞在冻干后仍能恢复生长。58本文档共88页；当前第58页；编辑于星期三\11点45分冻干细胞中的水分残存量微生物菌种冷冻干燥的储存效果，在很大程度上取决于样品中细胞的含水量。细胞中水分残存量与储存稳定性和储存期限密切相关，且存在种属间的差异。大多数微生物菌种冻干后的含水量应控制在2-3%。高水分残留比低水分残留对细胞的危害更大。59本文档共88页；当前第59页；编辑于星期三\11点45分水的冻结：

细胞膜表面的自由水：

接近环境中水的冻结温度

细胞中的游离水：

冻结温度约为-25℃

细胞中的结合水：

-100℃仍不冻结60本文档共88页；当前第60页；编辑于星期三\11点45分水溶液的冻结：

溶质改变水的物理性质

溶液的冻结从过冷开始

溶液的冻结温度：共晶点（饱和溶液的凝固点）

冰晶（异质冰晶）的形成与溶质含量和降温速度呈正相关

增加溶质浓度，加快降温速度，可以获得玻璃化冰晶。61本文档共88页；当前第61页；编辑于星期三\11点45分生活细胞的冻结细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键悬浮细胞的冻结首先是细胞外冻结。细胞外水的冻结温度为-5～-15℃细胞内游离水在-25℃冻结，-30℃时，细胞几乎没有非冻结状态的自由水存在。Luyet的二步冻结法先对细胞慢速降温（1℃/min）到-30℃，造成细胞外冻结，细胞内脱水。然后提高降温速度。62本文档共88页；当前第62页；编辑于星期三\11点45分细胞的超低温冻结即便在-70℃，细胞内某些酶类仍具备一定活性，使细胞进行简单、缓慢的代谢，导致细胞出现“衰老”现象。温度波动也会产生物理和化学反应，受溶液冻结、融化以及渗透压力变化的影响，细胞受到不同程度的损伤。这种低温损伤主要发生在0∽-60℃范围内。Meryman曾引证在-130℃无生化活性产生，因此推断，在-130℃或更低，生物代谢是停顿的。能够经受超低温冻结以及其后融化的生物，在超低温条件下，可实现无定限地保持原有性状存活。为实现细胞的超低温保存，一般均需在溶液中加入一定种类的低温保护剂并针对不同的细胞，设计特定的降温和复温程序。没有这些特定的条件，细胞在降温复温过程中必然会遭到低温损伤而死亡。63本文档共88页；当前第63页；编辑于星期三\11点45分冷冻对微生物细胞的致死损伤细胞的超低温冻存由三个技术步骤组成：细胞预冻；细胞在超低温下的长期储存；细胞冻融。致死损伤发生在预冻和冻融阶段。细胞的损伤是全方位的，包括：膜系统的完整性受损（膜的融合和膜的相变）；或亚细胞结构受破坏；或代谢酶失活（不利物质大量积累或必需营养物质大量分解）64本文档共88页；当前第64页；编辑于星期三\11点45分冷冻导致细胞损伤的机理1972年，Mazur等首先提出冷冻损伤的两因素假说。机械损伤：细胞内外冰晶生长而产生的机械力量造成膜结构损伤，从而影响细胞的生理、代谢功能的正常发挥。这是过快冷却所产生的，冷却速率越快，损伤越大。溶质损伤：水的冻结使细胞间隙内的液体逐渐浓缩，电解质浓度显著增加，胞内pH值和离子强度改变，潜在的不利化学反应发生率提高，如蛋白质变性，膜脂蛋白复合体的破坏；细胞膜脱水收缩达到临界最小体积时，会使细胞膜的渗透率产生不可逆的致命增加等。这是由于过慢冷却所产生，冷却速率越慢，细胞在高浓度溶液中暴露的时间越长，损伤越大。溶质损伤在预冻的某一温度范围内最为明显，这个温度范围在水的冰点和该溶液的全部固化温度之间，以较高速度越过这一温度范围，可以减弱溶质损伤。65本文档共88页；当前第65页；编辑于星期三\11点45分低温保护剂：

渗透型保护剂：

甘油、DMSO、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等。

使胞内压接近胞外压，降低细胞脱水皱缩的程度和速度；

易进出细胞，复温时缓解渗透性肿胀引起的损伤。

非渗透型保护剂：

聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、白蛋白等

使溶液呈过冷态，可在特定温度下降低溶质浓度；

使胞内水分提前部分渗出，缓解胞内冰晶的形成。66本文档共88页；当前第66页；编辑于星期三\11点45分国内外主要菌种保藏机构

菌种保藏机构的任务是在广泛收集生产和科研菌种、菌株基础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使用的目的。

中国：中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）；

美国：美国典型菌种保藏中心（ATCC）；

英国：国家典型菌种保藏所（NCTC）；

法国：里昂巴斯德研究所（IPL）；

日本：大阪发酵研究所（IFO）；

德国：科赫研究所（RKI）；

荷兰：真菌中心收藏所。67本文档共88页；当前第67页；编辑于星期三\11点45分第三节工业微生物菌种的选育一、工业微生物选育的目的：1、选育的目的改善菌种的特性，使产量提高，改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。微生物所发酵得到的产品，除了初级代谢产品如氨基酸和维生素外还有许多次级代谢产物。我们想要得到产物的两个成功要素在于（1）产生菌的选择；（2）采用什么样的选育方案（包括检测性能系统），还有不管寻找哪一类生物活性物质，在选择选育方法时必须要考虑两个要点即---选择性和灵敏性。菌种选育包括自然选育和诱变选育。68本文档共88页；当前第68页；编辑于星期三\11点45分2、选择性分离方法大致分为五个步骤：

（1）含微生物材料的选择；

（2）材料的预处理；

（3）所需菌种的分离；

（4）培养；

（5）菌落的选择和纯化。69本文档共88页；当前第69页；编辑于星期三\11点45分3、筛选时宜考虑的一些重要指标：

（1）菌的营养特征，在发酵过程中，常会遇到要求采用廉价的培养基or使用来源丰富的原料；

（2）菌的生长温度应选择温度较高的菌种这可以大大降低大规模发酵的冷却成本；

（3）菌是英语所选用的设备和生产过程；

（4）菌的稳定性；

（5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度；

（6）容易从培养液中回收产物；

（3）~（6）衡量分离达到的菌种的生产性能。70本文档共88页；当前第70页；编辑于星期三\11点45分二、菌种的经典选育方法

菌种的选育包括自然选育和诱变选育。

（一）自然选育：

自然选育是利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株，甚至可用来选育高产量突变株。

因此，它能达到纯化、复壮菌种，稳定生产，提高平均生产水平的目的。

自然选育一般有三种方法：

（1）从自然界分离菌种；

（2）从生产菌种中选育；

（3）从保藏菌株中选育。

71本文档共88页；当前第71页；编辑于星期三\11点45分自然选育流程图P22图2-172本文档共88页；当前第72页；编辑于星期三\11点45分（二）诱变育种：

诱变育种是指人工有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子中，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。

与自然选育比较，由于引进了诱变剂处理，因而加速了菌种突变的频率，扩大了变异的幅度，从而提高了获得优良特性的突变株的几率。

诱变育种的理论基础是基因突变，它是研究诱发机制的基础上选择合理的诱发因素，处理剂量及处理方法，再行运用合理的筛选程序及适当的筛选方法，把优良菌株选育出来。

73本文档共88页；当前第73页；编辑于星期三\11点45分 改变的环境条件称为诱变剂：具体定义：凡能显著提高生物体变异频率的因子称为诱变剂，常用的诱变剂依其性质分为物理诱变剂和化学诱变剂两大类。

（1）物理诱变剂

使用较多的紫外线（紫的波长136~390nm，对诱变有效果的范围200~300nm以260nm左右效用最大

）、X-射线（是高能电磁波，两者性质相似，X-射线波长0.06~136nm，r-射线是0.006~1.4nm）

r-射线、α、β-射线，超声波少用

（2）化学诱变剂

种类多：常有的：甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍（NTG）、氮芥（NM）、亚硝基甲基脲（NMU）等等，其中NTG和NMU因有突出的诱变效应人称“超诱变剂”74本文档共88页；当前第74页；编辑于星期三\11点45分1、诱变育种的一般步骤（如下图）

主要包括出发菌株的选择（选择纯种的、代谢特征符合要求的、对诱变剂敏感的菌株）、诱变处理（诱变剂的种类及处理剂量、影响因素的分析）和筛选突变株三个部分，75本文档共88页；当前第75页；编辑于星期三\11点45分76本文档共88页；当前第76页；编辑于星期三\11点45分2、诱变育种工作中应注意几个问题

（1）选择好出发菌株

选择好出发菌株对诱变效果有着积极的重要作用，有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用强。用这种菌株于生产是很有益的而用作出发菌株则不适宜,用作诱变的出发菌株必经对它的产量、形态、生理等方面了解。挑选出发菌株的标准是产量高，对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱变剂的使用及筛选条件。

（2）复合诱变因素的使用

在诱变育种中，可用多种物理、化学诱变因素，来处理菌种。对野生型菌株单一诱变因素有时也能取得好的效果，但对老菌种单一诱变因素重复使用突变的效果不高。这时可用复合诱变因素来扩大诱变幅度，提高诱变效果。如在青霉菌的选育中，先以氮芥处理很短时间，使之不足以引起突变，再用紫外线处理，可使诱变频率大为提高。

77本文档共88页；当前第77页；编辑于星期三\11点45分（3）剂量选择

各有各的剂量单位：如紫外线、焦耳、X-射线：库(仑)每千克,化学诱变因素（浓度）；不同的微生物使用的剂量不同,致死率取决于诱变剂量,而致死率和变异率之间有一定关系.因此可用致死率做为选择适宜剂量的依据,一般要经过多次的摸索.诱变效应随剂量的增大而提高,但达到一定剂量后,再增加剂量反而会使诱变率下降.所以要在实践中积累经验.

（4）变异菌株的筛选

一般应从菌落形态变异类型着手，去发现那些与产量有关的特性，并根据这些特性，分门别类地挑选一定数量的典型菌株进行发酵和鉴定，以决定各种类