生物技术细胞工程

第三章细胞工程本文档共155页；当前第1页；编辑于星期二\3点22分主要内容第一节概述第二节植物细胞工程第三节动物细胞工程第四节微生物细胞工程(发酵工程)本文档共155页；当前第2页；编辑于星期二\3点22分第一节概述细胞工程概念2.细胞工程的发展3.细胞工程的基础知识4.细胞工程的相关技术5.细胞工程的应用本文档共155页；当前第3页；编辑于星期二\3点22分细胞工程（cellengineering）：在细胞水平上，采用类似工程设计的方法，运用精巧的细胞学技术，有计划地改造遗传结构，从而获得特定的细胞及产物的有关理论和技术方法的学科。1.

细胞工程概念本文档共155页；当前第4页；编辑于星期二\3点22分广义的细胞工程

包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术狭义的细胞工程

指细胞融合和细胞培养技术。1.

细胞工程概念本文档共155页；当前第5页；编辑于星期二\3点22分根据不同的研究层次，细胞工程分为染色体工程、染色体组工程、细胞质工程、和细胞融合工程1.

细胞工程概念本文档共155页；当前第6页；编辑于星期二\3点22分染色体工程是按人们需要，添加，削减或替换生物染色体的技术，根据操作对象的不同，分为动物染色体工程和植物染色体工程。染色体组工程改变染色体组数的技术。如单倍体转变为多倍体，三倍体西瓜本文档共155页；当前第7页；编辑于星期二\3点22分细胞质工程又称细胞拆合工程，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质重新组合，重新建成新细胞细胞融合工程是利用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程本文档共155页；当前第8页；编辑于星期二\3点22分根据研究对象不同，细胞工程可分为动物细胞工程植物细胞工程微生物细胞工程本文档共155页；当前第9页；编辑于星期二\3点22分2、细胞工程的发展本文档共155页；当前第10页；编辑于星期二\3点22分细胞工程的发展植物细胞培养起源：20世纪初20世纪30年代，植物细胞培养研究取得突破1955年，激动素能促使培养细胞分裂20世纪60年代，建立植物原生质体培养和融合技术20世纪70年代，外源基因能够植入植物细胞体内1983年，第一个转基因植物培育成功20世纪90年代后，转基因植物进入产业化本文档共155页；当前第11页；编辑于星期二\3点22分动物细胞工程起源于疫苗的生产，1920-1950年，开发出病毒或细菌疫苗1951年开发能促使动物细胞体外培养技术50年代以后开始大规模培养动物细胞生产生物制品70年代基因基因重组和杂交瘤技术的研究1982年重组人胰岛素研究成功，标志着细胞工程商业化的开始本文档共155页；当前第12页；编辑于星期二\3点22分细胞工程的发展前景本文档共155页；当前第13页；编辑于星期二\3点22分过程离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根、芽植物体外植体脱分化植物激素：细胞分裂素、生长素再分化植物组织培养植物组织培养条件：

含有全部营养成分的培养基、一定的温度、空气、无菌环境、适合的PH、适时光照等。本文档共155页；当前第14页；编辑于星期二\3点22分本文档共155页；当前第15页；编辑于星期二\3点22分本文档共155页；当前第16页；编辑于星期二\3点22分植物细胞A植物细胞B原生质体A原生质体B原生质体融合正在融合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞愈伤组织杂种植株去细胞壁纤维素酶果胶酶物理方法化学方法：离心振动电刺激聚乙二醇细胞分裂植物组织培养植物细胞融合酶解法人工诱导方法过程本文档共155页；当前第17页；编辑于星期二\3点22分白菜甘蓝白菜－甘蓝本文档共155页；当前第18页；编辑于星期二\3点22分细胞分化和全能性

多细胞生物体是由各种各样形态和功能都不同的细胞群所组成。高等动、植物由受精卵细胞开始的胚胎发生过程随着细胞分裂次数的增加而使得早期胚胎的细胞数量也增加许多。其中有些细胞在形态、结构和功能上逐渐发生了差异，这种细胞之间差异的发生过程就是细胞分化。个体发育的过程就是细胞分化的过程，个体的各种器官和组织都是通过细胞分化形成的。3.细胞工程的基础知识本文档共155页；当前第19页；编辑于星期二\3点22分爪蟾的细胞核移植实验，证明细胞核的全能性本文档共155页；当前第20页；编辑于星期二\3点22分4.

细胞工程的相关技术无菌操作技术细胞培养技术细胞融合技术细胞核移植胚胎移植染色体工程克隆本文档共155页；当前第21页；编辑于星期二\3点22分无菌操作技术细胞工程的所有试验都要求再无菌条件下进行，要求十分严格的无菌操作。1、无菌室；2、超净工作台；3、生物材料的消毒；4、试验器械、器皿和药品的灭菌。本文档共155页；当前第22页；编辑于星期二\3点22分无菌操作室的灭菌与消毒缓冲间无菌室首次启用的无菌室一般可采用福尔马林熏蒸（5～6m2无菌室用KMnO450g，倒入100ml甲醛（用搪瓷盘），冒浓烟，24hr，氨水中和至无甲醛味），经常使用的无菌室在每次实验前必须开启紫外灯照射0.5至l小时，然后避光0.5至l小时后方可进入操作

本文档共155页；当前第23页；编辑于星期二\3点22分无菌室上风口下风口本文档共155页；当前第24页；编辑于星期二\3点22分缓冲间本文档共155页；当前第25页；编辑于星期二\3点22分培养器材的消毒干热灭菌法：玻璃器皿、金属器具等的消毒方法，140～150℃，2～3小时；湿热灭菌法：橡胶制品、无菌衣、帽和口罩以及除菌过滤器的清毒，高压蒸汽灭菌115℃20—30分钟；紫外线照射灭菌：多孔培养板的灭菌－30分钟。抽滤除菌：培养基等（培养基通过0.22m过滤装置－除菌）本文档共155页；当前第26页；编辑于星期二\3点22分细胞培养技术

细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件的保存和生长。1、取材和除菌；2、配制培养基，对培养基进行灭菌；3、接种、培养和传代。本文档共155页；当前第27页；编辑于星期二\3点22分两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。细胞融合技术的主要过程：1、制备原生质体；2、诱导细胞融合；3、筛选杂合细胞。细胞融合技术本文档共155页；当前第28页；编辑于星期二\3点22分细胞核移植：利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或将两个细胞的细胞核(或细胞质)进行交换，从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术。细胞核移植童鱼——世界上第一条没有父母的鱼“鲫金核质杂交鱼”本文档共155页；当前第29页；编辑于星期二\3点22分也称受精卵移植，是指把优良种畜的早期胚胎从供体母畜体内取出来，移到受体母畜的输卵管或子宫，“借腹怀胎”繁殖后代的技术。它是首先应用于繁殖家畜而发展起来的一种生物工程。试管婴儿胚胎移植本文档共155页；当前第30页；编辑于星期二\3点22分克隆是指生物体通过细胞进行无性繁殖形成基因型完全相同的后代个体，简称“无性繁殖”。例：多莉、克隆猴治疗性克隆

克隆技术本文档共155页；当前第31页；编辑于星期二\3点22分多利

克隆猴本文档共155页；当前第32页；编辑于星期二\3点22分277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。本文档共155页；当前第33页；编辑于星期二\3点22分预想的克隆人技术路线本文档共155页；当前第34页；编辑于星期二\3点22分5.

细胞工程的应用通过细胞培养物获得药物和其他有用的物质如人参皂甙通过植物细胞和组织培养获得快速繁殖的无性系植物产品，包括良种苗木、名贵花卉、稀有资源等如兰花细胞融合产品如单克隆抗体、番茄薯“二层楼”从细胞培养中筛选合乎希望的突变细胞株、再生突变植株，可培育新品种生殖工程上的应用如借腹怀胎、试管婴儿

本文档共155页；当前第35页；编辑于星期二\3点22分本文档共155页；当前第36页；编辑于星期二\3点22分美梦终究没有成功!!番茄薯“二层楼”本文档共155页；当前第37页；编辑于星期二\3点22分第二节植物细胞工程1.植物组织培养2.

植物细胞培养和次生代谢产物的生产3.单细胞分离技术4.植物体细胞杂交5.植物细胞原生质体制备与融合6.单倍体植物的诱发与利用7.人工种子本文档共155页；当前第38页；编辑于星期二\3点22分1.

植物组织培养植物组织培养（概念）是在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温度、湿度）条件下，研究、培养植物组织器官，甚至进而从中分化、发育出整体植株的技术。植物细胞的全能性（理论基础）

指具有完整细胞核的植物细胞，在一定条件下能不断分裂和繁殖、发育成完整植株的潜在能力。本文档共155页；当前第39页；编辑于星期二\3点22分1.

植物组织培养的相关概念脱分化

植物分化细胞进入细胞分裂周期，形成愈伤组织。再分化

脱分化的组织或细胞在一定的条件下可分化为各种不同组织的细胞类型。愈伤组织植物组织表面形成的一团无序生长的薄壁细胞团。外植体

能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段。本文档共155页；当前第40页；编辑于星期二\3点22分初代培养最初建立的外植体的无菌培养阶段继代培养将已形成愈伤组织或已分化出根、茎、叶、花等的培养物重新切割，转移到新的培养基上以进一步扩大培养试管苗通过组织培养所获得的再生植株本文档共155页；当前第41页；编辑于星期二\3点22分植物细胞工程的基础技术无菌操作技术组织培养细胞培养花药及花粉培养离体胚培养原生质体培养本文档共155页；当前第42页；编辑于星期二\3点22分植物组织培养应用试管苗的快速繁殖无病毒植物的培育提取次生代谢产物人工种子的培育转基因植物的生产本文档共155页；当前第43页；编辑于星期二\3点22分植物组织培养的研究意义运用组织培养方法可以在人为的条件下研究细胞、组织或器官的繁殖、生长和分化，研究环境条件对植物生长发育的影响。在工厂化育苗技术上，组织培养是工厂化育苗的生产配方研究和无病毒种苗扩繁必须经历的阶段；细胞培养技术在中草药方面的研究不仅可以探索药用植物生理遗传和成分生物合成等一系列理论问题，而且还可以为大规模细胞发酵生产药物提供理论依据和技术参数；在转基因植物种苗的研究与开发中，组织培养技术即是基本的研究手段，又是规模开发的基本生产形式。本文档共155页；当前第44页；编辑于星期二\3点22分外植体愈伤组织新植株本文档共155页；当前第45页；编辑于星期二\3点22分1.

植物组织培养进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段：1.预备阶段；2.诱导去分化阶段；3.继代增殖阶段；4.生根成芽阶段；5.移栽成活阶段。本文档共155页；当前第46页；编辑于星期二\3点22分预备阶段(1)选择合适的外植体；外植体的部位、年龄及大小。(2)除去病原菌及杂菌；对外植体除菌的一般程序如下：外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干(3)配制适宜的培养基。本文档共155页；当前第47页；编辑于星期二\3点22分培养基培养基的成分无机营养物，包括氮、磷、钾、钙、硫和镁等大量元素以及一些微量元素如锰、锌、铜、铁、硼碳源，如糖类，2％~4%的蔗糖或葡萄糖是适宜的碳源。维生素，维生素B1(硫胺素)是必需的。本文档共155页；当前第48页；编辑于星期二\3点22分培养基培养基的成分生长调节剂(植物激素)植物生长素，如IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、2,4-D(二氯苯氧乙酸)、2,4,5-T(三氯苯氧乙酸)。细胞分裂素，如BAP(苄氨基嘌呤)、6-BA(苄基腺嘌呤)、2-ip(异戊烯氨基嘌呤)、激动素(呋喃氨基嘌呤)。有机附加物，一般是蛋白质水解物、酵母提取物、麦芽提取物和椰汁。本文档共155页；当前第49页；编辑于星期二\3点22分培养环境条件光照强度、光质、光周期温度24-28度；最佳24-26度相对湿度容器相对湿度高达96%-100%；培养室70%-80%本文档共155页；当前第50页；编辑于星期二\3点22分诱导去分化阶段使各种细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，培养基中应添加较高浓度的生长素，其结果形成愈伤组织。本文档共155页；当前第51页；编辑于星期二\3点22分继代增殖阶段继代培养及时分离愈伤组织成适当大小转移到新配制的培养基上，促进愈伤组织生长增殖。本文档共155页；当前第52页；编辑于星期二\3点22分生根成芽阶段诱导胚状体的形成。胚状体：在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造。该阶段需细胞分裂素和光照。本文档共155页；当前第53页；编辑于星期二\3点22分咖啡的愈伤组织咖啡的胚状体本文档共155页；当前第54页；编辑于星期二\3点22分移栽成活阶段适度的光、温、湿条件。可在人工气候室中锻炼一段时间。本文档共155页；当前第55页；编辑于星期二\3点22分炼苗的原因试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度，近100%的相对湿度环境条件下生长从叶片上看，试管苗的角质层不发达，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛，甚至叶片上出现了大量的水孔，而且，气孔的数量、大小也往往超过普通苗

本文档共155页；当前第56页；编辑于星期二\3点22分石斛组培苗炼苗本文档共155页；当前第57页；编辑于星期二\3点22分组织培养的应用脱毒快速繁殖

快速繁衍珍稀濒危植物、名优特新品种和脱毒苗。植物种质资源的保存、挽救濒于灭绝的植物通过花药和花粉培养获得单倍体植株、缩短育种年限本文档共155页；当前第58页；编辑于星期二\3点22分脱毒原因：大多数农作物，特别是通过无性繁殖的植物，受到一种或多种病毒的侵染，导致产量和品质下降。外植体：茎尖或顶端分生组织有时茎尖培养需要与热处理或化学处理方法结合，才能起到有效的脱毒结果。脱毒苗：利用组织培养获得的无病毒植株。本文档共155页；当前第59页；编辑于星期二\3点22分草莓本文档共155页；当前第60页；编辑于星期二\3点22分快速繁殖植物组培苗快速繁殖的四个阶段无菌苗的建立组培苗的增殖生根移栽本文档共155页；当前第61页；编辑于星期二\3点22分百合本文档共155页；当前第62页；编辑于星期二\3点22分组培室本文档共155页；当前第63页；编辑于星期二\3点22分大花蕙兰本文档共155页；当前第64页；编辑于星期二\3点22分种质资源的保存保存一个细胞就相当与保存一粒种子，但所占的空间仅为原来的几万分之一，而且在-193度的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需要年年更新或经常更新。

本文档共155页；当前第65页；编辑于星期二\3点22分获得单倍体植株、缩短育种年限通过花药和花粉组织培养可以获得单倍体植物，大大缩短了育种时间。使新品种的培育过程大大简化本文档共155页；当前第66页；编辑于星期二\3点22分2.

植物细胞培养和次生代谢产物的生产植物细胞培养的发展植物细胞培养系统植物细胞培养的应用本文档共155页；当前第67页；编辑于星期二\3点22分植物细胞培养的发展1956年，Routier和Nickell提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物。之后，用此方法生产了哈尔碱、人参皂角苷、维斯纳精、紫杉醇等。目前，最大批量工业化培养细胞(烟草细胞)已达20吨。我国，培养红豆杉细胞生产紫杉醇(抗肿瘤)本文档共155页；当前第68页；编辑于星期二\3点22分植物细胞培养系统悬浮细胞培养系统适于大量快速地增殖细胞，但不利于次生物质的积累。固定化细胞培养系统细胞生长缓慢而次生物质含量高。本文档共155页；当前第69页；编辑于星期二\3点22分悬浮细胞培养系统悬浮细胞的来源：愈伤组织需分散细胞，其方法：用果胶酶打破细胞间的连接增加生长激素的浓度，加快细胞分裂和生长速度起始培养把已建立的愈伤组织转移到适当容器里的液体培养基中，然后置于摇床上不断振荡。本文档共155页；当前第70页；编辑于星期二\3点22分进液管排液管进气管出气管封闭式植物细胞培养系统优点：结构简单，易于操作缺点：次生代谢物积累较少本文档共155页；当前第71页；编辑于星期二\3点22分固定化细胞培养系统固定化细胞方法：包埋、吸附载体：海藻酸钙、K-角叉菜胶、琼脂及琼脂糖、聚丙烯酸凝胶、纤维膜、硅藻土、中空纤维、陶瓷等固定化细胞培养培养系统：平床培养系统、立柱培养系统本文档共155页；当前第72页；编辑于星期二\3点22分平床培养系统优点：设备简单，能更有效的合成次生代谢产物缺点：占地面积大，次生代谢产物累计不均匀，氧气供应有限本文档共155页；当前第73页；编辑于星期二\3点22分立柱培养系统优点：次生代谢产物的合成度增强，占地面积小本文档共155页；当前第74页；编辑于星期二\3点22分固定化细胞培养系统优点：稳定反应槽内的细胞量，使反应活性稳定，能长期连续运行；能提高反应效率在生物反应器中固定化细胞的密度比悬浮培养密度增加2~4倍包埋细胞抵抗剪切的能力增强，可使用简单的生物反应器本文档共155页；当前第75页；编辑于星期二\3点22分固定化细胞培养系统固定化细胞培养使细胞与培养基隔离，下游加工胞内产物得到简化，产物易于细胞分离。细胞生长和有效产物形成不偶联，优化产物形成而不影响细胞生长。使培养液的粘度极大降低，避免了悬浮培养中出现的细胞结团和透气差的问题。本文档共155页；当前第76页；编辑于星期二\3点22分3.单细胞分离技术

机械法酶解法本文档共155页；当前第77页；编辑于星期二\3点22分机械法叶片消毒－撕取也表皮暴露叶肉细胞－刮取细胞－培养叶片消毒－过滤、离心净化细胞－培养本文档共155页；当前第78页；编辑于星期二\3点22分酶解法果胶酶处理细胞，使细胞游离出来酶解液的渗透压偏低，会造成原生质体在细胞内崩解本文档共155页；当前第79页；编辑于星期二\3点22分本文档共155页；当前第80页；编辑于星期二\3点22分4.植物体细胞杂交

用两个来自不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法称为植物体细胞杂交本文档共155页；当前第81页；编辑于星期二\3点22分植物细胞A植物细胞B原生质体A原生质体B原生质体融合正在融合的原生质体再生出细胞壁杂种细胞愈伤组织杂种植株去细胞壁纤维素酶果胶酶物理方法化学方法：离心振动电刺激聚乙二醇细胞分裂植物组织培养植物细胞融合酶解法人工诱导方法过程本文档共155页；当前第82页；编辑于星期二\3点22分5.植物细胞原生质体制备与融合原生质体的制备原生质体的融合杂合体的鉴别与筛选本文档共155页；当前第83页；编辑于星期二\3点22分原生质体的制备取材与除菌材料来源植物的各组织和器官主要来源：叶片、愈伤组织、悬浮培养细胞、茎尖、根尖、子叶、胚性组织细胞(花粉)除菌肥皂水－清水（3）－酒精（70％）－次氯酸钠（3％）本文档共155页；当前第84页；编辑于星期二\3点22分原生质体的制备酶解常用的酶：纤维素酶、果胶酶、崩溃酶、半纤维素酶、蜗牛酶需要在酶液中加入适量的渗透稳定剂，常用的渗透稳定剂是甘露醇和山梨醇等糖醇。

分离过滤、低速离心、比重漂浮本文档共155页；当前第85页；编辑于星期二\3点22分原生质体的制备洗涤鉴定形态观察台盼蓝、荧光素双醋酸酯本文档共155页；当前第86页；编辑于星期二\3点22分分离原生质体步骤本文档共155页；当前第87页；编辑于星期二\3点22分本文档共155页；当前第88页；编辑于星期二\3点22分荧光显微镜下的原生质体烟草本文档共155页；当前第89页；编辑于星期二\3点22分原生质体的融合原生质体融合也称体细胞杂交，就是使分离下来的不同亲本的原生质体之间在人工控制的条件下，像性细胞受精作用那样互相融合成一体。

常用的融合方法化学法诱导融合物理诱导融合本文档共155页；当前第90页；编辑于星期二\3点22分化学法诱导融合聚乙二醇(PEG)结合高钙高pH诱导融合法双亲原生质体滴加PEG滴加高钙高pH溶液洗涤离心筛选，再生本文档共155页；当前第91页；编辑于星期二\3点22分PEG介导本文档共155页；当前第92页；编辑于星期二\3点22分物理诱导融合电融合电融合处理一般可分两步进行，先给两极交变电流，产生电泳效应，使原生质体沿着电场的方向排列成串珠状，这时再给予瞬间的高强度电脉冲，使原生质体膜局部破损而导致融合。

本文档共155页；当前第93页；编辑于星期二\3点22分电融合本文档共155页；当前第94页；编辑于星期二\3点22分上图：电流作用下原生质体排成列右上：两个原生质体融合右下：三个原生质体融合本文档共155页；当前第95页；编辑于星期二\3点22分杂合体的鉴别与筛选杂合细胞的显微鉴别利用亲本原生质体大小、颜色的差异互补筛选杂合细胞遗传互补法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，使杂种细胞表现正常功能如白化互补(aaBB×AAbb)本文档共155页；当前第96页；编辑于星期二\3点22分杂合体的鉴别与筛选互补筛选杂合细胞生长互补法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异性来选择杂种细胞的方法抗性互补筛选法：利用亲本原生质体对抗生素、除草剂及其他有毒物质的抗性差异来选择杂种细胞代谢互补法本文档共155页；当前第97页；编辑于星期二\3点22分亲本细胞1亲本细胞2同型融合细胞异核融合细胞未融合细胞含药物A和B的培养基存活死亡死亡对药物B敏感对药物A敏感本文档共155页；当前第98页；编辑于星期二\3点22分杂合体的鉴别与筛选利用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别本文档共155页；当前第99页；编辑于星期二\3点22分6.

单倍体植物的诱发与利用单倍体生物是指细胞中仅含一组染色体的个体。单倍体植物种质纯，不受显性等位基因的掩盖与遮蔽效应影响，人们易于从中挑选出具有可用性状的隐性突变体，其经济意义十分显著。自然发生途径？本文档共155页；当前第100页；编辑于星期二\3点22分6.

单倍体植物的诱发与利用实验室诱导单倍体植株的途径花药培养花粉培养未授粉子房或胚珠的培养杂交法获单倍体植株本文档共155页；当前第101页；编辑于星期二\3点22分花药培养

选取成熟度适中的花蕾或幼穗。花药预处理：高渗，高温或低温。选择适当的培养基和培养条件。本文档共155页；当前第102页；编辑于星期二\3点22分花粉培养由于花药培养时一些二倍体的花药壁细胞也形成愈伤组织，从而增加了培育单倍体植株的难度。1974年Nitsch等首创用挤压法分离花粉进行培养的方法，只得到约5%的花粉植株。1977年，Sunderland等提出了自然散开法收集花粉的方法，使花粉成株率有所提高，但与花药培养相比仍低得多。本文档共155页；当前第103页；编辑于星期二\3点22分未授粉子房或胚珠的培养

子房、胚珠中的成熟胚囊由6个单倍体细胞（包括一个卵细胞）和一个具两个极核的中央细胞构成。1976年，SanNoeum首先从大麦未授粉子房培养获单倍体植株。由于诱导出的植株大多是单倍体绿苗，因此这可能是一个发展方向。本文档共155页；当前第104页；编辑于星期二\3点22分杂交法获单倍体植株

杂交，特别是远源杂交，杂种胚在胚胎发育过程中往往会将一方亲本的染色体逐步排出，最终将得到仅含一方染色体的单倍体植物。1970年Kasha利用该原理将球茎大麦与普通大麦杂交，培育出了普通大麦的单倍体胚和植株。由本方法得出的单倍体胚长成的植株都是绿苗，这是本法的突出优点。本文档共155页；当前第105页；编辑于星期二\3点22分单倍体培养物的加倍在诱发单倍体植株的各阶段（愈伤组织、幼胚及小苗），都可用0.2%—0.4%秋水仙素处理24-48小时，然后按常规途径培养，即可获得染色体加倍的能正常开花、结果的二倍体植株。本文档共155页；当前第106页；编辑于星期二\3点22分7.

人工种子的研制人工种子即人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。本文档共155页；当前第107页；编辑于星期二\3点22分人工种子的构成及特点人工胚乳胚状体人工种皮本文档共155页；当前第108页；编辑于星期二\3点22分人工种子的构成及特点人工种子具有以下突出的优点：不受环境因素制约，可以进行工厂化生产；经无性繁育产生，有利于保存优良性状；与试管苗相比，成本更低，适合机械化耕种；可根据需要在人工胚乳中添加营养物、农药等。本文档共155页；当前第109页；编辑于星期二\3点22分人工种子的制备胚状体的制备及其同步生长人工胚乳的制备配制包埋剂及包埋本文档共155页；当前第110页；编辑于星期二\3点22分胚状体的制备及其同步生长诱导胚状体同步化生长的措施：低温法抑制剂法：DNA合成抑制剂分离法通气法：氮气、乙烯渗透压法自然干燥4-7天本文档共155页；当前第111页；编辑于星期二\3点22分人工胚乳的制备常用的人工胚乳：MS(SH、White)培养基+马铃薯淀粉水解物0.5×SH培养基+麦芽糖本文档共155页；当前第112页；编辑于星期二\3点22分配制包埋剂及包埋海藻酸钠中添加营养成分CaCl2溶液中形成人工种皮约10分钟，使之固化无菌水冲洗后即可播种本文档共155页；当前第113页；编辑于星期二\3点22分人工种子的贮存与萌发人工种子的贮存与萌发使迄今尚未攻克的难关。一般要将人工种子保存在低温（4-7℃）、干燥（<67%相对湿度）条件下。费用昂贵。本文档共155页；当前第114页；编辑于星期二\3点22分挪威云杉的人工种子本文档共155页；当前第115页；编辑于星期二\3点22分桉树的人工种子（发芽中）本文档共155页；当前第116页；编辑于星期二\3点22分第三节动物细胞工程1.

细胞组织培养2.

动物细胞融合3.

单克隆抗体技术4.

细胞拆合5.干细胞工程本文档共155页；当前第117页；编辑于星期二\3点22分动物细胞工程理论基础胚胎干细胞与全息胚学说-细胞全能性动物细胞工程与植物细胞工程的比较目的，技术手段，理论基础，诱导手段等本文档共155页；当前第118页；编辑于星期二\3点22分本文档共155页；当前第119页；编辑于星期二\3点22分动物细胞工程技术手段一、动物细胞大规模培养技术1、培养条件：35-37度2、培养方式：贴壁培养、悬浮培养、固定化培养3、抗凋亡技术本文档共155页；当前第120页；编辑于星期二\3点22分细胞培养法组织培养法培养物的传代培养物的长期保存1.细胞组织培养本文档共155页；当前第121页；编辑于星期二\3点22分大多数动物细胞具有贴壁生长的特性，其大规模培养方法有：微导管培养法微载体培养法葡聚糖聚合物微胶囊培养法褐藻酸钠细胞培养法本文档共155页；当前第122页；编辑于星期二\3点22分组织培养法将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。

本文档共155页；当前第123页；编辑于星期二\3点22分将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔

本文档共155页；当前第124页；编辑于星期二\3点22分用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥向肾门，去肾外膜及脂肪，本文档共155页；当前第125页；编辑于星期二\3点22分剪碎组织本文档共155页；当前第126页；编辑于星期二\3点22分接种组织块本文档共155页；当前第127页；编辑于星期二\3点22分移入培养箱中（注意贴有组织块的一面朝上），静止2～3小时，然后将细胞培养瓶轻轻翻转，继续静止培养。本文档共155页；当前第128页；编辑于星期二\3点22分24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已被污染；若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则培养液pH过高；若培养液显为橙黄、橘红且清澈，一般显示细胞生长良好。在相差显微镜下观察，若此时见细胞自组织边缘长出。继续培养3～5日，再换部分或全部培养液，待多数组织块的生长晕相接，小心挑掉组织块，继续培养3～4天，细胞贴满细胞培养瓶壁时便可进行传代培养。观察本文档共155页；当前第129页；编辑于星期二\3点22分培养物的传代悬浮培养的细胞：定期将其转移到新鲜培养基中组织培养物：需剥离组织本文档共155页；当前第130页；编辑于星期二\3点22分经典传代法冷冻保存(液氮)5%-10%的二甲亚砜(DMSO)10%玻璃化保护剂(PVS2)培养物的长期保存本文档共155页；当前第131页；编辑于星期二\3点22分2、动物细胞融合用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞（含有原来2个细胞的染色体）的过程。亲缘较远的生物体之间是无法正常杂交的，但他们之间的体细胞却往往能彼此融合，产生出杂种细胞本文档共155页；当前第132页；编辑于星期二\3点22分细胞融合的意义1、克服植物远缘杂交不亲和性、2、扩大遗传重组范围、增加变异、创造新品种3、单克隆抗体的生产本文档共155页；当前第133页；编辑于星期二\3点22分动物细胞融合有以下三条途径：

病毒诱导融合化学诱导融合电激诱导融合本文档共155页；当前第134页；编辑于星期二\3点22分常用的病毒：

副粘液病毒(副流感病毒如仙苔病毒)、天花病毒、疱疹病毒等促融机制：靠病毒表面含有神经氨酸酶一些突起的作用病毒诱导融合本文档共155页；当前第135页；编辑于星期二\3点22分化学诱导融合常用的促融剂：

聚乙二醇(PEG)促融机制：PEG降低细胞表面的极性，导致脂双层不稳定，引起细胞融合本文档共155页；当前第136页；编辑于星期二\3点22分3.单克隆抗体技术基本原理单抗制备流程本文档共155页；当前第137页；编辑于星期二\3点22分淋巴细胞杂交瘤技术：是将可以分泌单一抗体的淋巴细胞与可以无限增殖的骨髓瘤细胞融合，获得兼具两种细胞特性的杂交细胞。这种细胞可以大量增殖并产生纯一的抗体，即单克隆抗体。这一技术被誉为免疫学上的一次重大革命。单克隆抗体：由单一克隆的B淋巴细胞产生的抗单一抗原的高度特异性抗体，具有专一性强、质地均一、反应灵敏、可大规模生产等特点基本原理本文档共155页；当前第138页；编辑于星期二\3点22分基本原理通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。两种细胞：骨髓瘤细胞特征：再培养条件下无限分裂、增殖；次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺失脾淋巴细胞(经抗原免疫)特征：分泌抗体功能和能够在选择培养基上生长融合后，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆本文档共155页；当前第139页；编辑于星期二\3点22分单抗制备流程本文档共155页；当前第140页；编辑于星期二\3点22分本文档共155页；当前第141页；编辑于星期二\3点22分4.细胞拆合从不同的细胞中分离出细胞器及其成分，在体外将它们重新组装成具有生物活性的细胞或细胞其的过程称为细胞拆合。包括核移植和染色体转移等。本文档共155页；当前第142页；编辑于星期二\3点22分

核移植进行核移植研究的目的：异种核质关系研究；中间性状鱼细胞核遗传全能性的研究。胚胎早期细胞、体细胞本文档共155页；当前第143页；编辑于星期二\3点22分爪蟾的细胞核移植实验，证明细胞核的全能性本文档共155页；当前第144页；编辑于星期二\3点22分动物克隆可以分为三个阶段：同种胚胎细胞克隆动物同种体细胞克隆动物异种体细胞克隆动物本文档共155页；当前第145页；编辑于星期二\3点22分同种胚胎细胞克隆动物1981年Illmenses率先报告用小鼠幼胚细胞核克隆出正常小