现代生物技术导论-发酵工程

第九讲发酵工程发酵工程及特点古老的新技术:发酵技术发展历程发酵原理:人类如何利用微生物发酵产品的生产:现代发酵工业发酵工程及特点发酵的概念发酵工程的特点发酵的概念

发酵(Fermentation)英文来自拉丁语ferver,意思是“发泡”.描述果汁或谷物发酵时产生CO2的现象.实际上,在后来的啤酒果酒生产中,起泡现象一直作为重要的直观指标.发酵的概念

巴斯德认为:发酵是酵母在无氧状态下的呼吸过程,是生物获得能量的一种形式.发酵的概念

现代发酵定义:利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制造产品的过程.葡萄糖代谢

三羧酸循环

发酵的特点微生物的共性发酵工程的特点微生物的共性体积小,面积大吸收多,转化快生长旺,繁殖快适应强,易变异分布广,种类多PetriDiskCultivationofaPureStrain发酵工程的特点

反应条件温和:常温常压原料来源广泛并无需精制众多反应都在同一发酵罐内完成发酵技术发展历程

古代发酵近代发酵现代发酵古代发酵距今8000至4500年前开始(中国),距今4000至3000年前开始(外国)特点只知现象,不知本质产品米酒啤酒近代发酵—纯培养技术的建立巴斯德(LouisPasteur,1822-1895)于1857年发现了发酵是由微生物引起的,从而使传统的经验发酵变成了一门科学.巴斯德发明的消毒器现代化工厂仍采用巴氏消毒法巴斯德消毒法：60～65℃作短时间加热处理，杀死有害微生物人们心中的巴斯德免疫学——预防接种首次制成狂犬疫苗近代发酵—纯培养技术的建立布雷费尔德(Brefeld)于1872年创立了霉菌纯培养技术.丹麦科学家汉逊(Hansen)1878年创立了酵母纯培养技术德国科学家科赫(RobertKoch,1843-1910)于1881年创立了细菌纯培养技术.德国人柯赫（RobertKoch）（1843～1910）近代发酵—纯培养技术的建立上述技术突破,人们可以控制发酵进程,从而使发酵技术从天然发酵走向纯种发酵.完成了发酵技术的第一次转折.主要产品:酒精甘油丙酮-丁醇现代发酵通气搅拌发酵

代谢控制发酵

基因工程菌发酵

通气搅拌发酵

英国科学家弗莱明(A.Fleming),1929年发现了青霉素英国科学家弗洛里(Haward.Flory)和钱恩(E.B.Chain)精制分离出青霉素(1940年)第二次世界大战对青霉素的急切需求推动了工业化生产(1944年)技术关键无菌空气制备,通风搅拌发酵代表产品青霉素意义：完成了发酵技术的第二次技术转折代谢控制发酵代谢控制发酵1959年木下祝郎发明了用微生物发酵发生产谷氨酸.味精的分子式为:HOOC-(CH2)2CHNH2COONa.H2O技术特点从DNA分子水平上控制(无定向诱变)微生物代谢途径,进行最合理代谢.该技术的发展完成了发酵技术的第三次转折.代表产品:氨基酸核苷酸等基因工程菌发酵1970S以来基因工程技术的飞速发展,为发酵工程技术插上了腾飞的翅膀,人们可以定向改变生物的性状和功能,创造新的“物种”,是发酵工业能够生产出超出自然界微生物所不能合成的产物.技术特点:可定向改造生物基因,按人们的意志生产产品.意义:将引起发酵工程的技术革命.产品:人生长素,干扰素,疫苗发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，是生物技术四大支柱产业化的核心，无论传统发酵产品，如抗生素、氨基酸等，还是现代基因工程产品，如疫苗、人体蛋白质等，都需要发酵技术进行生产。发酵工程在现代生物技术中的地位和作用发酵原理与机制黄色短杆菌赖氨酸的合成与调节机制细胞膜通透性的改造发酵中如何控制关键条件回忆一个概念反馈抑制:代谢途径的末端产物(即终产物)过量时,这个产物反过来直接抑制该途径第一个酶的活性,使整个反应过程减慢或停止.反馈抑制

协同反馈抑制分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式.单独一种产物过量并不能引起抑制作用.协同反馈抑制黄色短杆菌生物合成Lys调节机制黄色短杆菌生物合成Lys调节机制酶3活性比酶2高15倍,代谢优先生成高丝氨酸酶4活性比高丝氨酸激酶高,代谢优先向蛋氨酸方向进行蛋氨酸过量反馈阻遏酶4,3的合成异亮氨酸过量反馈抑制酶5的活性苏氨酸过量反馈抑制酶3的活性,并且与过量赖氨酸协同抑制酶1的活性积累赖氨酸的菌株特性通过基因突变使酶3失去活性,切断向苏氨酸方向的代谢流在培养液中加入限制量的高丝氨酸(或苏氨酸和蛋氨酸)细胞膜通透性的改造用能积累谷氨酸菌株做如下实验:生物素充足时,细胞内含大量谷氨酸,但培养液里几乎不含谷氨酸.用溶菌酶消化细胞壁得到的原生质体仍不分泌谷氨酸.当把原生质体放入低渗溶液里,将其涨破,谷氨酸才排出.生物素亚适量时,培养液里含大量谷氨酸,细胞里含量少.结论

谷氨酸的分泌是由细胞膜控制细胞膜的结构怎样?磷脂分子形成细胞膜磷脂分子结构式生物素缺陷型可分泌谷氨酸营养缺陷型:微生物因突变不能合成某种必需生长因子,需外加该因子才能生长的菌株.如高丝氨酸营养缺陷型.

生物素是脂肪酸合成最初反应关键酶的辅酶,生物素缺陷型菌株不能合成生物素,通过控制生物素亚适量,使磷脂合成不完全而导致细胞膜渗漏.从而使谷氨酸分泌到细胞外发酵工程关键技术生物反应器：

机械搅拌式

气升式 过程参数检测（实时在线与离线）：

pH，溶氧，温度，搅拌

菌体，产物，底物，RQ(呼吸商)等发酵过程控制：

pH，溶氧，温度，底物流加等发酵工艺发酵工艺流程发酵工艺主要组成部分微生物生长得数学模型发酵工艺流程发酵工艺组成部分培养基制备↓“种子”培养→发酵罐→产物的提取精制↑无菌空气微生物的营养元素水平:CHONPSClK…化合物水平

C:糖,脂,有机酸,醇,烃等

N:氨基酸,蛋白质,尿素等

O:溶解氧

P,S,Cl,K等:主要来自含该元素的无机盐.原料水平C:葡萄糖,蔗糖,淀粉,糖蜜,天然气,乙酸,乙醇及氨基酸和蛋白质类物质等.N:各种氨基酸,蛋白胨,酵母粉,鱼粉,豆饼粉,麦皮,尿素,硝酸胺等.O:空气或氧气等.P,S,Cl,K等:K2HPO4,KH2PO4,NH4Cl,MgSO4.好氧发酵的氧为何如此重要

氧是一种难溶气体，在标准条件下，空气中的氧在纯水中的溶解度为0.25mol/m3左右。对于菌体浓度为1015个/m3的发酵液，假定每个菌体的体积为10-16m3（直径为5.8μ），细胞呼吸强度为2.6*10-3molO2/(kg干细胞.s)，菌体密度为1000kg/m3，含水量为80%，则每立方米发酵液的需氧量为:

2.6×10-3×10-16×1015×1000×0.2=0.052molO2/m3S=187.2molO2/m3h

在1小时里菌体的需氧量是溶解量的750倍。因此，溶解氧的供给常常是好氧发酵的限制性因素。微生物生长的化学计量

对产黄青霉以葡萄糖和NH3为原料进行通气培养，经测得菌体的元素组成为CH1.92O0.61N0.16，只与菌体生长有关的葡萄糖消耗转化系数为Y=88。6g菌体/mol葡萄糖.菌体生长原料消耗的计量关系。C6H12O6+NH3+O2→CH1.92O0.61N0.16+CO2+H2O求出1摩尔C对应菌体所含元素总摩尔数(相当于分子量)为12+1×1.92+16×0.61+14×0.16=25.92Y=88.6g菌体/mol葡萄糖=3.42mol菌体/mol葡萄糖然后按顺序配平C,N,H,OC6H12O6+0.55NH3+2.39O2→3.42CH1.92O0.61N0.16+2.58CO2+3.54H2O微生物生长的数学模型假设发酵微生物是细菌(分裂方式为一分为二),发酵刚开始细胞浓度为X0,在一小时内有部分细胞分裂.设分裂细胞的分率为µ,1h分裂的细胞数为µX0.经1小时后细胞的浓度为X1:X1=µX0+X0=X0(1+µ)经2小时后细胞的浓度为X2:X2=X1(1+µ)=X0(1+µ)2经t小时后细胞的浓度为Xt:Xt=X0(1+µ)t我们把一小时分成ξ个无穷小的单位时间,则在一个无穷小的时间单位内分裂的细胞的分率为ε=µ/ξ,并且有:X1’=X0(1+ε)X2’=X1’(1+ε)=X0(1+ε)2X1=X0(1+ε)ξ→(1+ε)ξ=(1+µ)Xt=X0(1+ε)ξt=X0((1+ε)1/ε)µtLim(1+ε)1/ε=eε→0Xt=X0eµtdX/dt=X0deµt/dt=µX0eµt=µX实际生长比速dX/Xdt=µ-kX解上述微分方程，设U=1/X得dU/dt+µ

U=k求解得1/X=Ae-µt+k/µ边界条件t=0,X=X0解得X=k/µ/(1+((k/µ-X0)/X0)e-µt)发酵设备及检测控制系统

B|Braun公司发酵罐：Biostat系列参数检测多级控制：

人工

DCU

MFCSBiostatB2BiostatED10BiostatBPilotBiostatUD50DCU数字式控制单元MFCSFermentorDisplay现代发酵工程规模低值工业品大型化

以规模来取胜（几十数百吨）。如味精、氨基酸、有机酸、抗生素、饲料、食品工业用产品等；高价值转基因产品小型化（几十数百升）。基因工程大肠杆菌、酵母菌高密度培养；动物细胞植物细胞培养；研究中心智能化、全能性。现代发酵工程

对工艺控制的需要规模生产

必要的检测手段

准确的执行成熟的工艺控制策略实验室研究

完善的检测手段

全能性的过程控制软件 发酵过程工艺的

后续改进研究青霉素（几百倍的提高）菌种改造要求新工艺市场竞争要求成本降低新的工艺控制策略

以高密度培养为例

Gln目前国内生产谷氨酰胺的专业厂家只有3--4家，其生产能力低，而且采用的