生物医学电镜技术与细胞及组织超微结构总论演示文稿

生物医学电镜技术与细胞及组织超微结构总论演示文稿本文档共66页；当前第1页；编辑于星期二\3点12分6/27/20231（优选）生物医学电镜技术与细胞及组织超微结构总论本文档共66页；当前第2页；编辑于星期二\3点12分6/27/20232（一）、电镜技术发展简史⑴、RobertHooke(1665)&Leeuwenhoek(1674)发现细胞；⑵、19世纪30年代,Schleiden(1938)&Schwann（1839）提出细胞学说(celltheory)；⑶、1932年，德国Knoll&Ruska建造第一台电镜(ElectronMicroscope,EM,×12);1933～1934年,电镜的性能已达光镜的分辨率0.2um,×10,000；1938-1939，第一批商品电镜问世，分辨率达100A；由于受到样品制备技术的限制，20世纪50年代初，电镜技术才开始运用于生物医学方面的研究。⑷、细胞超微结构的分子细胞生物学的基础。本文档共66页；当前第3页；编辑于星期二\3点12分6/27/20233(二)、分辨率与形态研究的关系1、分辨率（Resolution）

又称分辩本领（Resolvingpower），是将邻近两点清晰区分、辩认的能力，用能被辨认的邻近两点的距离表示。肉眼：在明视距离（25cm）时，为0.25mm；LM：可见光的平均波长为500nm，r=λ/2，LM的极限分辨率为0.25um;EM：电子波波长短,且波长随加速电压的增高而更短，目前较好的电镜分辨率为0.2nm左右,比LM提高1000倍,比人眼提高100万倍.(注)：①由于电镜存在各种像差（包括球差、像散等）,限制了分辨率,不能真正达到其波长的一半;②分辨率还受到许多因素的影响,如切片的厚度等，超薄切片较薄时,分辨率可达1～2.5nm,切片较厚时,实际分辨率为5～10nm.本文档共66页；当前第4页；编辑于星期二\3点12分6/27/202342、反差：

被观察物与其背景在亮度（黑白对比度）上有所不同，这种差别称为反差；透射电镜的反差主要由样品对电子的散射产生。3、空放大

不能提供更为清晰的图像放大，称为无效放大，也称无效放大。4、不同分辨率的形态研究本文档共66页；当前第5页；编辑于星期二\3点12分6/27/202355、亚微结构与超微结构的概念及关系亚显微结构（submicroscopicstructure）：介于细胞水平和大分子水平之间的结构；简称为“亚微结构”或“亚细胞结构（subcellullarstructure）”，也称“细微结构（finestructure）”超微结构（ultrastructure）：严格的讲，是指分子水平的结构，目前一般书刊对亚显微结构和超微结构无严格的界限，往往将普通光镜分辩界限以下的结构笼统称为超微结构。本文档共66页；当前第6页；编辑于星期二\3点12分6/27/20236(三)、基本原理、构造及电镜的类型电镜的基本构造及原理①、电子束主要特点：a、由电子组成，真空中直线前进，具波动特性；b、电子束受电力和磁力作用；c、电子束照射样品时，能透过极薄样品，得到透射电子，或产生二次电子，特征X射线，背散射电子等。本文档共66页；当前第7页；编辑于星期二\3点12分6/27/20237②、电镜的基本构造：以透射电镜为例本文档共66页；当前第8页；编辑于星期二\3点12分6/27/20238电镜的类型①、透射式电子显微镜(TransmissionElectronMicroscope,TEM)；最常用、最典型，主要用于观察超薄切片和负染样品，点分辨率的理论值可达1.4～2A。②、扫描式电子显微镜（ScanningElectronMicroscope，SEM）；具有景深长，视野广，观察样品表面立体图像的特点，其分辨率和放大倍数都远低于TEM，一般分辨率为60A左右。上述两种电镜可综合，兼有功能，是现代电镜发展的代表（STEM）。本文档共66页；当前第9页；编辑于星期二\3点12分6/27/20239③、超高压电镜（HighVoltageElectronMicroscope,HVEM）；常规电镜加速电压一般在200KV以下，如果加速电压在500KV以上，则称为HVEM。特点:观察厚切片(0.5-3um)，提高分辨率。观察到原子水平，期望观察生活标本（含水份）④、分析电镜（ElectronMicroscopeMicroanalyser，EMMA）；I、波谱仪（wavelength-dispersivespectrometer，WDS）II、能谱仪（energy-dispersivespectrometer，EDS）⑤、扫描探针显微镜(Scanningprobemicroscope,SPM):原子力显微镜(atomicforcemicroscope,AFM)；扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope,STM)。本文档共66页；当前第10页；编辑于星期二\3点12分6/27/202310本文档共66页；当前第11页；编辑于星期二\3点12分6/27/202311本文档共66页；当前第12页；编辑于星期二\3点12分6/27/202312本文档共66页；当前第13页；编辑于星期二\3点12分6/27/202313本文档共66页；当前第14页；编辑于星期二\3点12分6/27/202314本文档共66页；当前第15页；编辑于星期二\3点12分6/27/202315本文档共66页；当前第16页；编辑于星期二\3点12分6/27/202316③、扫描电镜的二次成像原理扫描电镜一般可分为四个重要的组成部分：a、形成电子探针的电子光学系统；b、探针的电子束打击样品表面形成信息信号；c、检测系统；d、电子偏转系统（是电子探针在样品表面按一定顺序扫描，并且使这一扫描过程与阴极射线管的电子束在荧光屏上移动同步）。本文档共66页；当前第17页；编辑于星期二\3点12分6/27/202317本文档共66页；当前第18页；编辑于星期二\3点12分6/27/202318扫描电镜的结构示意图：本文档共66页；当前第19页；编辑于星期二\3点12分6/27/202319本文档共66页；当前第20页；编辑于星期二\3点12分6/27/202320本文档共66页；当前第21页；编辑于星期二\3点12分6/27/202321本文档共66页；当前第22页；编辑于星期二\3点12分6/27/202322本文档共66页；当前第23页；编辑于星期二\3点12分6/27/202323本文档共66页；当前第24页；编辑于星期二\3点12分6/27/202324本文档共66页；当前第25页；编辑于星期二\3点12分6/27/202325本文档共66页；当前第26页；编辑于星期二\3点12分6/27/202326(四)、细胞超微结构研究的展望①、二维三维，如三维重建技术；②、从单纯的形态观察,深入到对其功能、代谢、化学组成、分子结构及元素分布的研究。如X线显微分析(electronprobex-raymicroanalysis)；③、定性描述定量测定方向发展，如电镜形态测量技术（morphometry）；④、从经化学固定的结构向活细胞整体方向发展，如超高压电镜技术的应用；⑤、仪器设备向小型化方向发展。本文档共66页；当前第27页；编辑于星期二\3点12分6/27/202327本课程的重点内容①电镜生物样品制备常规技术及应用范围;②电镜图片的分析要领;③正常细胞超微结构理论和超微病理内容的基本掌握。学习要点①重视图像的分析和识别；②注意LM和EM结合；③形态与功能的联系；④正常超微结构与超微病理的联系；⑤建立整体的细胞结构和功能概念。主要参考文献①电子显微镜术在临床医学的应用,杭振镳蔡文琴主编,重庆出版社,1988年8月,第一版；②医学细胞生物学,宋今丹主编,人民卫生出版社,1997年5月,第一版；③医用电子显微学，薄爱华主编,人民卫生出版社,2000年11月,第一版；④超微病理学基础,武忠弼主编,人民卫生出版社,1990年9月,第一版；⑤UltrastructuralPathologyoftheCellandMatrix.ThirdEditionVol.1FeroceN,GhadiallyButterworths1988本文档共66页；当前第28页；编辑于星期二\3点12分6/27/202328电镜生物样品制备技术

样品制备是电镜技术中一个很重要的组成部分，是电镜工作中最繁重的环节。要学习掌握好细胞超微结构知识及应用电镜技术进行研究工作，都必须首先了解电镜的标本制备技术，故属于本课程的重点内容。本文档共66页；当前第29页；编辑于星期二\3点12分6/27/202329（一）、超薄切片及其染色技术超薄切片（ultrathin-section）制备过程示意图：本文档共66页；当前第30页；编辑于星期二\3点12分6/27/2023301、取材的基本原则：快：1min小：1mm3利：静：冷：4℃取材部位要准确；成批取材，部位一致、；标本的编号和标签。本文档共66页；当前第31页；编辑于星期二\3点12分6/27/2023312、固定：①、几种常用的固定剂的理化特性和使用原则：a、四氧化锇（Osmiumtetroxide，OsO4）；又称锇酸，是电镜生物样品使用最广泛的固定剂，兼有电子染色作用，可作单固定，一般不用于电镜细胞化学实验的固定。对糖原和核酸的保护作用差。多用于后固定。b、戊二醛（glutaraldehyde，C5H8O2）；不能单独作为电镜样品固定液，对脂肪的保护作用差。没有“电子染色”的作用，通常用于前固定。c、甲醛（formaldehyde）。电镜多用多聚甲醛，对酶活性保存好，可与戊二醛混合或单独用于细胞化学灌流固定或作为前固定液。②、固定方法：

a、双重固定法；b、体内原位固定法；c、灌流固定法。

本文档共66页；当前第32页；编辑于星期二\3点12分6/27/2023323、脱水：应递增浓度进行4、浸透：半浸透纯浸透5、包埋、聚合：环氧树脂（epoxyresin）618#，Epon8126、切片：修块光切（半薄切片，0.5-1um）定位超切(超薄切片,50-70nm)超薄切片机(ultramicrotome)，玻璃刀，钻石刀，复有支持膜的载网（grid）（铜、镍、金网）。本文档共66页；当前第33页；编辑于星期二\3点12分6/27/2023337、电子染色：利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程度，以增强明暗之比（反差）。①常用的电子染色剂有以下几种

a、醋酸铀（Uranylacetate），即醋酸双氧铀，多用于块染；b、枸橼酸铅（Leadcitrate），用于片染，易被空气中的CO2污染。

②电子密度（electrondensity）的概念：本文档共66页；当前第34页；编辑于星期二\3点12分6/27/202334（二）、负染技术利用高密度无结构的重金属物质把生物标本包绕起来。这种反差是负像（与正染色的超薄切片相比较）。最常用的染色剂是磷钨酸钠（phosphotungsticacid，PTA），此法常用于病毒、蛋白分子或细胞亚单位的分子结构研究，制样简单，可作快速诊断。本文档共66页；当前第35页；编辑于星期二\3点12分6/27/202335（三）、电镜细胞化学技术

（electronmicroscopiccytochemistry）在保持细胞超微结构完整的条件下，借助细胞中的化学反应，研究细胞乃至细胞器的结构与功能的关系，是与化学、生物化学及免疫学有密切联系的一门学科。广义的电镜细胞化学研究方法主要有细胞超微标记示踪技术、电镜酶细胞化学技术和电镜免疫细胞化学技术（简称免疫电镜技术）等几种。本文档共66页；当前第36页；编辑于星期二\3点12分6/27/2023361、电镜酶细胞化学术(electronmicroscopiccytochemistryofenzymeorultracytochemistryofenzyme)基本原理及内容:酶细胞化学术（enzymecytochemistry）是利用酶催化反应特点，从亚微结构上研究酶的分布和活性。按其催化反应的性质可分为水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、合成酶和异构酶六大类，应用较多的有水解酶和氧化还原酶。现以水解酶为例，介绍此技术的主要过程和基本原理。初级反应：底物被磷酸水解酶作用后分解产生磷酸。底物磷酸水解酶H3PO4

最终反应：磷酸与金属捕捉剂结合形成反应产物。H3PO4捕捉剂（如Pb2+）Pb3(PO4)2↓反应产物为电子致密的沉淀物，电镜下易于观察并显示出酶的定位。近年来常用铈（Ce3+）作为捕捉剂。本文档共66页；当前第37页；编辑于星期二\3点12分6/27/202337本文档共66页；当前第38页；编辑于星期二\3点12分6/27/202338应用一般说透射电镜已能分辨出超微结构和某些化学成份，如糖原颗粒、核糖体、染色质和脂类等。电镜酶细胞化学则着重显示各超微结构的酶特别是标志酶，研究细胞器的化学、功能及其动态变化，由于电镜方法的限制，迄今所能显示的酶为数尚少。酶细胞化学技术主要用于：（1）酶在超微结构上的定位，（2）标记和鉴定某些细胞和细胞器，（3）通过显示过氧化物酶，定位示踪HRP,（4）利用免疫酶技术，电镜下显示特异性标记物的定位。目前应用电镜技术常显示的标志酶有：各种细胞器的标志酶细胞器标志酶内质网核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶高尔基体焦磷酸硫胺素酶（Trans膜囊）、烟酸胺腺嘌呤二核苷磷酸酶（中间膜囊）溶酶体酸性磷酸酶微体过氧化氢酶线粒体细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氨酶细胞膜核糖核苷磷酸酶（如ATP酶）、碱性磷酸酶本文档共66页；当前第39页；编辑于星期二\3点12分6/27/202339Figure10G-6-PasereactionproductswererichinLeydigcellofthecontrolgrouprats.×20000Figure11G-6-Pasereactionproductsdecreasedmarkedlyafter3dofcadiumtreatment.×20000Figure12ShowingintenseG-6-PasereactionproductsofLeydigcellafter3dofcadiumaddzinctreatment.×20000本文档共66页；当前第40页；编辑于星期二\3点12分6/27/202340本文档共66页；当前第41页；编辑于星期二\3点12分6/27/202341RER,G-6-PasePlasmalemma,AlPMito.,SDH本文档共66页；当前第42页；编辑于星期二\3点12分6/27/2023422、免疫电镜技术(immunoelectronmicroscopy)

免疫细胞化学术（immunocytochemistry）是用标记特异性抗体对组织内抗原分布进行形态学研究的一门分支学科。60年代，Nakane建立了酶标记抗体技术，70年代，Sternberger在此基础上改良并建立了非标记过氧化物酶--抗过氧化物酶（PAP）技术，80年代Hsu建立了抗生物素--生物素（ABC）法之后，胶体金标记技术、免疫金银染色和亲和免疫细胞化学技术等相继问世，使免疫细胞化学技术成为当今生物医学中形态、功能、代谢综合研究的一项有力工具。目前免疫细胞化学正在向定量和分子水平发展。本文档共66页；当前第43页；编辑于星期二\3点12分6/27/202343

常用免疫电镜方法的原理及步骤

PAP法

基本原理：PAP（peroxidase-antiperoxidase）法，又称可溶性酶--抗酶法。特点为参加反应的抗体都不被酶直接标记。包括以下步骤：①用第一抗体（Ab1）与组织中特异性抗原（Ag）相结合形成抗原抗体（Ag－Ab1）复合物；②用第二抗体（Ab2）的一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离，形成抗原--第一抗体--第二抗体（Ag-Ab1-Ab2）复合物；③用过氧化物酶--抗过氧化物酶复合物（PAP，与Ab1同种动物的血清）与第二抗体的游离Fab段结合，形成Ag-Ab1-Ab2－PAP复合物；④用过氧化氢和二氨基联苯胺（DAB）使PAP的过氧化物酶形成不溶的、暗棕色的嗜锇化合物。

优点：①保存抗体活性好；②PAP复合物稳定；③敏感性高，比间接免疫荧光抗体法敏感性高100～1000倍；④由于敏感性高,节约了抗体用量,也减少了非特异性背景染色。

缺点：①反应产物颗粒较大，遮盖背景；②DAB有致癌作用，操作中需格外小心；③内源性氧化酶对此法有干扰。本文档共66页；当前第44页；编辑于星期二\3点12分6/27/202344本文档共66页；当前第45页；编辑于星期二\3点12分6/27/202345ABC法

基本原理：抗生物素--生物素--过氧化物酶复合物技术（Avidin-Biotin-PeroxidaseComplexTechnique）简称ABC技术，是目前常用的免疫细胞化学技术之一。1979年Guessdon首先把生物素--卵白素技术用于免疫组织化学，先后设计出桥式卵白素--生物素（BAB）技术和标记式卵白素一生物素（LAB）技术，1981年Hsu和许世明在BAB法和LAB法基础上改良而建立了ABC法，其基本原理与PAP法相似，特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的过氧化物酶，形成抗原--第一抗体--生物素标记的第二抗体--抗生物素过氧化物酶复合体（Ag－Ab1－Ab2－ABC）。抗生物素又称卵白素（Avidin），它有四个活动结合点，并与生物素有特别高的亲和力，一旦和生物素结合就极为稳定。当生物素和第二抗体共价偶联后，就使第二抗体获得与抗生物素相结合的能力。本文档共66页；当前第46页；编辑于星期二\3点12分6/27/202346本文档共66页；当前第47页；编辑于星期二\3点12分6/27/202347胶体金标记技术优点：（l）胶体金可标记各种不同的生物大分子(如免疫球蛋白、葡萄球菌A蛋白、植物凝集素、刀豆球蛋白A等)，并使其保持原有的生物学活性。（2）胶体金标记技术可适用于光镜、透射及扫描电镜、X射线能谱分析、荧光显微镜等。（3）胶体金非特异性吸附作用小、特异性强。（4）金颗粒电子密度大，电镜下检出率远比DAB反应产物高，敏感性比PAP法高20～200倍、比ABC法亦高数倍。（5）胶体金标记物是颗粒状物，电镜下易于计数，可直接定量检测抗原。（6）胶体金标记不受内源性物质影响。（7）胶体金颗粒直径可根据需要控制，将不同直径的肢体金分别标记不同抗体或抗原，可在同一张切片上同时区分两种或两种以上的抗原或抗体，特别适合于电镜水平的双标记或多标记。（8）胶体金标记和IGSS特别有利于回顾性研究,如过去病理外检的石蜡切片和电镜包埋块,需要时可进行胶体金标记研究。胶体金的颗粒较大,穿透性弱,是它的主要缺点。电镜水平的免疫金技术，同PAP和ABC法免疫电镜一样，关键在于抗原的保存。用L.R.White和LowicrylK4M包埋，其保存抗原优于Epon812，用冷冻超薄切片作IGS，由于抗原性保存很好，更易成功。目前多采用包埋后染色。包埋前染色，免疫金试剂对细胞膜的穿透性差,一般只用于细胞表面抗原的标记。本文档共66页；当前第48页；编辑于星期二\3点12分6/27/202348本文档共66页；当前第49页；编辑于星期二\3点12分6/27/202349（四）、真空喷镀和离子溅射技术真空喷镀：

真空条件下金属加热至一定温度后，将以细颗粒向四周发射，在样品面对喷镀源的一面形成一层重金属薄膜。又称金属投影法（metalshadowing）。离子溅射：

与真空喷镀的区别在于：真空度不同，重金属离子运动的方向不同，镀膜效果较前者好，金属用量可少10倍，镀膜更为均匀。本文档共66页；当前第50页；编辑于星期二\3点12分6/27/202350（五）、冷冻蚀刻技术（freezeetching）及冷冻割断技术（freezefracture）冷冻蚀刻技术又称冷冻蚀刻复型法（freezeetchingreplica），该技术主要用于生物膜内部及细胞内部三维结构的研究，如核孔复合体、细胞连接等。本文档共66页；当前第51页；编辑于星期二\3点12分6/27/202351本文档共66页；当前第52页；编辑于星期二\3点12分6/27/202352本文档共66页；当前第53页；编辑于星期二\3点12分6/27/202353（六）、扫描电镜样品制备技术

本文档共66页；当前第54页；编辑于星期二\3点12分6/27/202354（七）、电镜X线显微分析术（electronmicroscopicX-raymicroanalysis）

又称电子探针X线显微分析（electronprobeX-raymicroanalysis）或简称X线微区分析（X-rayMA），是电镜技术与X线分析技术相结合的一种方法。基本原理：当高速电子束轰击固体标本表面的微小区域，使该区域所含的元素发射X线，各种元素都能发射自己的特征X线，通过检测发射的X线的波长和强度，便可了解该微小区域所含元素的种类及含量。分析仪器包括：a、电子探针显微分析仪；b、扫描电境与X线检测器的结合；c、扫描透射电境与X线检测器的结合；d、专用分析电镜（electronmicroscopemicroanlyser，EMMA）；e、透射电镜与X线检测器的结合。本文档共66页；当前第55页；编辑于星期二\3点12分6/27/202355优点：①、分析过程不破坏样品结构，在保持各元素原有分布情况下对生物细胞内各种元素同时进行分析；②、结合拍摄透射或扫描电镜图像，可在形态观察的同时对一定结构内的元素进行测量，从而获知超微结构变化与其组成元素变化的关系。③、灵敏度高，可辨别＜1um3区域内质量小于10-14g的元素。应用：中药研究，钙库研究，重金属中毒（如镉）研究等。本文档共66页；当前第56页；编辑于星期二\3点12分6/27/202356(八)、电镜细胞立体形态计量技术用立体学方法来分析形态结构，称为形态计量学（morphometry）或体视学，形态定量分析目的是从二维图像推导出三维结构参数。①人工法；②生物医学图像分析系统（九）、扫描血管铸型（casting）技术

观察和研究腔隙性器官，特别是器官内的血管立体构筑和分布情况。铸型剂----甲基丙烯酸酯样品经腐蚀，清洗，镀膜后在SEM下观察。（十）、特殊样品制备①甲醛固定石蜡包埋样品；②培养细胞及游离细胞；③血液（白细胞、血小板），精液等液体标本；④骨组织。本文档共66页；当前第57页；编辑于星期二\3点12分6/27/202357本文档共66页；当前第58页；编辑于星期二\3点12分6/27/202358电镜技术在生物医学中的应用基础研究方面：

在病毒学、细胞生物学、组织学、病理学、分子生物学及分子病理学上均做出了卓有成效的贡献。如核蛋白体超微结构的研究；核蛋白体与mRNA关系的阐明；核小体的发现；DNA复制及RNA转录的分子形态观察；线粒体内膜的ATP合成酶颗粒的发现；电镜是直接观察病毒的唯一工具。临床医学方面：电镜在医学上的应用近10多年来已从医学基础性理论研究逐渐扩大到临床医学的实际应用方面。对疾病的病情、病因的鉴定，对肿瘤、血液病及肾脏病等的分型诊断上都取得显著成效。由于内窥镜的应用和穿刺技术的发展，使得临床上获得如心脏、肝、肾、胃等脏器的标本变得较容易。本文档共66页；当前第59页；编辑于星期二\3点12分6/27/202359本文档共66页；当前第60页；编辑于星期二\3点12分6/27/202360正确评价电镜的使用：电镜是一种先进的科学仪器，其主要特点是分辨率高，能观察细微结构。但正是由于其高放大，使得观察范围较小，且制样复杂。而光镜则有制样简单，观察面大，能动态观察活细胞等优点。因此电镜不能取代光镜，二者应配合使用，取长补短。在科学研究中，电镜所起作用具体表现为：

a、探查作用：观察很早期的改变，功能活动的提示，因复杂的代谢过程中的定位往往是光镜看不见的；病毒学、病因学、免疫损伤等病因的探讨；b、依据作用：“眼见为实”的重要性，在机理研究中从形态学上证实了许多理论假说；C、辅助作用：电镜结果注意与光镜的关系，与宏观的关系，因其本身有较大的局限性，如取材小，观察范围亦小，特别是在病理诊断上应与其他方法结合进行研究。本文档共66页；当前第61页；编辑于星期二\3点12分6/27/202361观察要领1、正确判断和应用放大倍