临床基因扩增检验操作规范

关于临床基因扩增检验操作规范第1页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求三、PCR污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析第2页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三一、临床基因扩增检验实验室的

规范化设置及其各室的功能规范化设置：要求参照《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号文）附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。第3页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三

1.四个隔开的工作区域中每一区域都须有

专用的仪器设备。2.明确的标记，如加样器或试剂等。3.单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区。4.使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。5.实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。6.各自的清洁用具。第4页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三

各室功能：第5页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（一）试剂贮存和准备区

功能：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。第6页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三

含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。戴手套。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，一般照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。第7页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（二）标本制备区

功能：临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。第8页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三

要正确使用加样器。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。

第9页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（三）扩增区

功能：DNA或cDNA扩增。第10页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三

已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。如有加样则应在超净台内进行。打开反应管前快速离心数秒。第11页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（四）扩增产物分析区

功能：扩增片段的测定。第12页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三

膜上微孔板上探针杂交方法、Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意实验人员的安全防护。

负压条件。第13页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三二、各阶段操作要求

测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。第14页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（一）标本的采集

临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。

EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的强抑制剂。

玻璃器皿在使用前应高压处理，250°烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。

临床用于RNA（如HCVRNA）扩增检测的血标本应尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。第15页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（二）标本的稳定化处理DNA：不需特殊稳定化处理。RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使DNA酶和RNA酶失活。第16页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（三）标本的运送

可在常温下通过邮寄运送，如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于RNA扩增检测的GITC稳定化处理的标本。未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。

第17页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（四）标本的贮存1.血清/血浆等—-70℃2.用于DNA测定的已纯化核酸样本—4℃3.用于RNA测定的已纯化核酸样本—-80℃4.用乙醇沉淀的核酸样本—-20℃5.GITC处理的RNA标本在室温可保存7天

第18页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（五）标本的处理（核酸提取）

抑制物可能来源于：标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）。

痰须液化处理。

第19页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）注意：①离心管不能插得过低，以防进水；②水浴时不能加盖，防管盖爆开；③水浴时间须准确，10±1min；④水浴时不能走开；⑤左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。第20页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增

有多种因素可引起核酸扩增检测假阴性结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg++浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极为重要。第21页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三RT-PCR操作注意：①标本必须新鲜；②做RNA标本的枪头离心管必须无菌；③冰上操作；④处理完后须立即上机，不能放置；⑤注意左右手分开。第22页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（七）扩增产物的分析扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。第23页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三实时荧光定量PCR在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程，最后通过曲线进行定量分析。与一般荧光定量PCR使用荧光强度定量不同，实时荧光PCR一般使用Ct（每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，Ct与模板初始拷贝数的对数成线性关系。实时荧光PCR的优点：精密度高，重复性能好。第24页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三TaqMan荧光定量PCR原理

探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，TaqDNA聚合酶的5’-3’外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；荧光信号强度与扩增产物量成正比；第25页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三第26页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三第27页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三三、PCR污染与对策PCR污染分环境污染与反应液污染二种。常见PCR污染源有三个：第一、标本间的交叉污染；第二、实验室中克隆质粒的污染；第三、PCR产物的污染（Carryover）。第28页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三要防止PCR污染，必须做好以下3个环节的工作：（一）污染的预防（二）污染源的追踪（三）污染源的处理第29页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（一）污染的预防操作PCR时，按照下述规则可有效地预防PCR的污染。1、PCR的前处理及后处理要在不同的隔离工作台上或房间内进行。2、分装试剂，标记批号第30页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三3、改进实验操作：

(1)带一次性手套；(2)避免反应液的飞溅；(3)用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于空气，以免产物气溶胶污染；(4)操作多份样品时，要先将可混匀的成分(dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准混合液(Mastermix)；(5)制备反应混合液时，最后加入样品DNA，加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧反应管。4、检查结果的可重复性。第31页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（二）污染源的追踪第32页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三1、阳、阴性对照

选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品。

阴性对照的选择一定要小心。

不含模板DNA的PCR试剂对照。第33页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三2、常见的环境污染源有(1)点杂交的点样器；(2)切片机；(3)离心机；(4)切胶用刀或微解剖刀；(5)浓缩用具，真空瓶；(6)电泳装置和紫外灯箱；(7)干冰/乙醇或水溶锅；(8)冰箱门把手、冷冻架和门把手。第34页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三追踪可疑的环境污染源①用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分②在0.1ml去离子水中浸泡；③取5μl作PCR反应；④电泳检查结果。第35页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（三）污染源的处理第36页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三1.环境污染处理法（1）稀酸处理法。对擦试实验阳性部位或器件可用1mol/LHCl擦洗或浸泡残留DNA。（2）紫外法：UV照射波长一般选择254/300nm，需考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布。UV对长片段（500bp以上）有效，而对短片段效果不大。第37页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三2.反应液的污染处理法(1)DNaseI法：PCR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5UDNaseI，室温下作用30min后，加热灭活，加入模板和Taq酶后即可进行正常PCR。

优点：便宜，不需知道扩增DNA序列。第38页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三(2)内切酶法：选择识别四个碱基的内切酶（如MspI等），最好几种合用，可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上，只是DnaseI由内切酶（MspI10U）代替，作用时间延长到1.0～1.5h。(3)紫外照射法：反应中不加模板与Taq酶。第39页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三(4)尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：dUTP代替反应中的dTTP，使产物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU的位置，阻止Taq酶的延伸。PCR正常循环前，用UNG处理PCR反应混合液可消除PCR产物的污染，而UNG在正常PCR循环变性一步就会失活，所以，对含dU的新合成PCR产物没有影响。第40页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三

TATATATATA

PCRAUAUAU

UNGAAA

加热

AAA

×

PCR第41页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三该法优点：①去除任河来源（包括引物在内）的污染；②由于污染的产物有大量dU存在，因此，UNG处理会彻底消除污染。③UNG处理与PCR扩增可在同一试管内进行。第42页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三四、因操作欠规范导致的问题分析第43页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（一）实验室仪器设备1、设备不齐全、不配套，使得实验结果不稳定，引起假性结果。

旋涡混合器，微量加样器，正规的紫外透射仪。RNAPCR样品处理时，血清（或血浆）中加入强烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。吸头与微量加样器不配套。2、PCR热循环仪的差异或质量问题。第44页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三移液器：①严禁大力来回拧动；②严禁调至容量之外使用；③第二档为排空档，不得作吸取之用；④吸头应浸入液面2—3mm处吸取；⑤严禁将有液体的移液器平放或倒置；⑥混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解；⑦每周用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。第45页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三离心机：①离心前，离心管须配平；②将调速档打至0档位，才能打开电源开关，逐渐升高转速，直至即定转速；③定时旋钮不能强行归零；④转头未停止时，严禁打开盖板。第46页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（二）实验室布局不合理引起的污染问题1、样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片段均会通过空气进行传播。2、PCR结果检测实验室和其它实验室在一起，会出现严重的扩增子污染。3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公用，也会造成严重污染。4、实验室操作垃圾（吸头、离心管、样品杯等）乱放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室污染。

第47页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（三）PCR操作中存在问题分析1.阳性变阴性2.阴性变阳性3.PCR结果不稳定第48页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三1.阳性变阴性

(1)有些阳性病人，经过PCR检测后为阴性，可能有两种情况：一是采集标本方法或部位不正确，二是如果病人取样部位病原体消失，需根据病人的病理情况采样。第49页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三(2)标本保存不当，可引起PCR失败。收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了PCR检测的模板或造成标本污染。第50页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三2.阴性变阳性

常见的原因有以下6点：

第51页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三①加入试剂或样品时引起的交叉污染

（最好在加完所有其他反应成分，包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA，将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻单击管侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心[10秒]，使水相和有机相分开）。第52页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三②加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染

（将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。

第53页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三③打开标本管盖引起样品飞溅

（打开前须瞬间离心）④操作时手套引起的交叉污染

（拿过模板DNA管后应更换手套）第54页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三⑤不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染

（必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加）。⑥实验室污染

第55页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三3.PCR检测结果不稳定（1）样品处理方法不当，标本中杂质很多，血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。蛋白质——DNA电泳带拖尾血红素中的卟啉化合物——抑制Taq酶活性代谢产物——干扰引物配对

第56页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三（2）操作不当带来的后果

主要指不能严格按照说明进行操作造成PCR检测失败。如HCVRNAPCR样品处理试剂A、B、C和75%乙醇的操作过程。

第57页，讲稿共61页，2023年5月2日，星期三50μl血清标本

(标本可用血清或血浆，尽量避免使用肝素做抗凝剂，避免反复冻融)

加200μl试剂A后立即混匀

(试剂A是强烈的变性剂