内质网内的泛素化机制

内质网内的泛素化机制关于内质网的泛素化机制内质网内的泛素化机制当蛋白质经过内质网(endoplasmicreticulum,ER)的时候，会有一套“质控，，系统暂时将那些新合成的蛋白质“扣留，，下来，帮助它们成熟。只有折叠正确的蛋白质才会被“释放”，而那些不能成熟的蛋白质则会被继续“关押”，但是的功能。因此，为了维持内环境的稳态，蛋白质质控系统会将这些“不合格产品”移交到胞质溶胶当中，在那里，被蛋白酶体降解掉。随着在越来越多的病理过程当中发现了内质网质控系统功能缺陷的现象，我们也开始逐渐意识到细胞内这条作用机制的重要性。在所有人类基因组编码的蛋白质当中，大约有20%的蛋白质被认为是分泌性蛋白质。这些分泌性蛋白质在到达它们的最终的目的地之前都需要先经过内质网的处理，这些目的地广泛分布在细胞各处，例如细胞膜上，各种胞内或胞外的腔室(Exocytoticandendocytoticcompartments)，以及细胞外表面等等。内质网不仅仅只是提供了一个D容器||，它同时还提供了众多的分子伴侣，帮助蛋白质折叠、成熟。不过虽然细胞提供了这些帮助，蛋白质在合成过程当中仍然非常容易出错。大约有1/3的新生蛋白质会在翻译过程中或者在翻译后数分钟之内被降解掉。这些蛋白质是因为在转录过程、翻译过程、成熟过程或折叠过程中出现了某些错误，或者各个亚基之间的合成不平衡，从而不能形成正确的构象而被降解的。即使是成熟的蛋白质也会因为各种诸如高能辐射、化学损伤、代谢产物等等环境因素而被损伤。这些损伤蛋白会聚集在一起，也会出现功能障碍，这都会影响到内质网以及细胞内环境的稳态。因此，进化机制赋予了内质网控制蛋白质质量的功能，这套质控系统可以在好几个层面对蛋白质进行监控，维持内质网的完好性。在蛋白质刚刚合成时它们会通过一个特异性的N连接聚糖(N-linkedglycanstructure)结构被保护起来，可以免遭降解。随后，那些可能发生错误折叠的蛋白质会被内质网中廿露糖苷酶(mannosidase)生成的一种D聚糖密码(glycancode)||所标记(图1)。然后，锚定在内质网膜上的泛素连接酶会破译该D密码||，需要被降解的蛋白质被转运出内质网，经由泛素化途径被26S蛋白酶体降解掉，该过程也被称为内质网相关的降解途径(ER-associateddegradation，ERAD)。发生错误折叠的蛋白质并不是唯 个进入ERAD系统的底物，ERAD系统还可以调控甾醇合成途径，它可以在甾醇过多的情况下降解掉甾醇合成途径中的限速酶，以此来控制合成速度。关于内质网的泛素化机制图1蛋白质在内质网内的降解途径。错误折叠的蛋白质在内质网内被降解掉需要以下几个步骤。首先（步骤1）,附着在内质网膜上的泛素连接酶与其他辅助因子一起识别出折叠错误的蛋白质。然后在步骤2所示的错位阶段，蛋白质经由一目前尚不清楚的通道被转运进入胞质溶胶之中。步骤3中，在内质网的胞质溶胶面，底物蛋白被E3泛素连接酶泛素化修饰。最后在步骤4中，在AAA+ATP酶和Cdc48蛋白的作用下，底物蛋白从膜上被去除掉，进入26S蛋白酶体，被降解处理。科研人员们最开始借助生化技术和遗传筛选的方法发现了一批ERAD系统的组成单位。不过现在，由于发现了细胞对发生折叠错误的糖蛋白进行降解的途径，大家的目光又都投向了ERAD系统的功能研究方向。在本文中我们将介绍内质网蛋白质控系统是如何能够选择、处理出错的蛋白质，但同时又不会降解掉新生蛋白的机制。因为ERAD途径似乎是非常保守的一条途径，可见于从酵母细胞到哺乳动物细胞等种类众多的真核生物细胞，因此我们选择酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）作为研究对象，来研究其中的机制，同时这也丰富了我们的知识，又进一步扩展了研究范围（以往只对哺乳动物进行过这方面的研究）。在图2中，我们给出了酵母细胞和哺乳动物细胞中ERAD系统的组成因子，以及这些因子在细胞内的分布情况。关于内质网的泛素化机制图2酵母细胞和哺乳动物细胞中的蛋白质降解机制。分子伴侣和糖基水解酶47(glycosylhydrolase-47)家族蛋白Mns1andHtml能发现折叠错误的蛋白质，并使其与内质网膜结合连接酶DoalO、RMA1、HRD相结合。当底物蛋白与内质网胞质溶胶面结合后就会被E3连接酶泛素化修饰。所有的泛素连接酶复合体都含有一个重要的含有指环催化结构域的E3连接酶，一个E2结合酶以及其他一些辅助因子蛋白。AAA+ATP酶Cdc48蛋白能使泛素化修饰的底物蛋白从内质网膜上脱离下来。配体蛋白(adaptorproteins)Rad23andDsk2能促使泛素化修饰的底物蛋白进入26S蛋白酶体被降解，同时，Png1蛋白能借助Rad23蛋白的作用使糖蛋白去糖基化。图中酵母蛋白以紫色表示，哺乳动物蛋白以绿色表示。1.葡聚糖与蛋白质折叠内质网内蛋白质控系统最主要的作用就是将未正确折叠的蛋白质扣留在内质网中。Hsp70伴侣蛋白以及葡聚糖依赖的分子伴侣蛋白(glycan-dependentchaperone)会与非天然蛋白结合，防止其转运至高尔基体，而且还可以与氧化还原酶类(oxidoreductases)蛋白一起帮助构象不正确的蛋白重新折叠，改变其构象。传统的观点认为，蛋白运送装置只会在蛋白质正确折叠之后才根据其氨基酸序列中的D离开信号(exitsignals)||将其转运出内质网。另一种观点则认为，在决定是否将蛋白质转运出内质网时存在一个比较宽泛的标准，是依据蛋白质的能量（级）状态和细胞的折叠环境而定的（图3和背景知识1）。关于内质网的泛素化机制图3内质网中的蛋白质处理途径。蛋白质经由Sec61蛋白被转运入内质网中之后（如图中步骤1所示），未折叠的蛋白质在分子伴侣的作用下可以被折叠成正确的构象F，如图中步骤2所示。外向转运因子能选择这些折叠正确的蛋白质并将它们运送至高尔基体，如图中步骤3和4所示。而滞留因子则会阻止未折叠的蛋白质离开内质网，如图中步骤5所示。分子伴侣会努力帮助任何折叠发生错误的蛋白质恢复成未被折叠的状态，使其能够重新进行正确的折叠，如图中步骤6所示。在步骤7中，滞留因子会使折叠错误的蛋白质停留在内质网中，最终，这些异常蛋白质以及一部分处于折叠中间状态的蛋白质会经胞质溶胶途径被降解，如图中步骤8所示。KU^F和KU^M表示反应的平衡常数。背景知识1：关于蛋白质外向转运的灵活标准通常大家都会认为外向转运机制（exportmachinery）只会运输那些折叠正确、构象天然的蛋白质，而所有的异常蛋白质都会被降解掉。这说明内质网（endoplasmicreticulum，ER）会使用一种固定的，统一的，以野生型蛋白质的构象为标准的质量控制标准。但是这种理论却无法解释为什么有些细胞能分泌突变型蛋白质。在内质网中究竟是一种什么标准在进行蛋白质的质量控制工作。了弄清楚由甲状腺素转运蛋白(transthyretin,TTR)引起的组织特异性的淀粉样变性疾病(tissue-specificamyloiddiseases)的发病机制，Sekijima等人证明了TTR突变体蛋白的分泌情况与D折叠稳定性分值(foldingstabilityscore)||有关。这个分值集合了热力学稳定性情况(thermodynamicstability)，即伸展的多肽链与折叠状态多肽链之间的Gibbs自由能差异(Gibbsfree-energydifference)；和动力学参数，比如TTR形成四聚体的速率等等。相应的，不同组织蛋白分泌效率上的偏差也似乎是由于分子伴侣、外向转运机制以及为细胞外向转运机制制定各自标准的ERAD系统之间各自活性上的差异造成的。比如，在某种细胞中，某一特定蛋白可能会被转运出去，但是在另一种组织细胞中却可能会被降解，这是因为分子伴侣的低活性降低了用于判断蛋白是否被外向转运的D折叠稳定性分值||的阈值。Wiseman等人在Sekijima试验的基础之上又开发出了一套关于蛋白质折叠外向转运的定量模型，即FoldEx模型，该模型将内质网中复杂的内环境网络系统简化成了几条基本的代谢通路，包括易位(translocation)、不需要分子伴侣的蛋白折叠途径和需要分子伴侣的蛋白折叠途径、蛋白外向转运途径以及ERAD途径，每一条途径都被看做一个独立的单元(图3)。上述这每一条途径的作用都与酶的作用一关于内质网的泛素化机制样，可以通过MichaelisCMenten动力学常数表示出来。Wiseman等人结合了几种不同的方程，用数学的方法描述了蛋白质以折叠平衡常数(foldingequilibriumconstant)为基础的外向转运效率，该效率与热力学稳定性情况有关。这种理论研究的方法正确的解释了我们在试验中观察到的现象，即在一个特定的细胞特异性环境当中，蛋白质折叠分子的绝对热力学稳定性决定了它们的外向转运效率oFoldEx模型同样也解释了为什么即使是非常稳定的蛋白质，比如CTFR等包含多个结构域的蛋白质或者是多亚基组成的蛋白质复合体，如果折叠的过慢也会被降解掉，该模型告诉我们，蛋白质的外向转运效率取决于ERAD途径与外向转运途径之间的活性对比情况，也取决于蛋白质发生错误折叠的速度，这也就是说当蛋白质更容易发生错误折叠时，蛋白质的外向转运效率就会降低。FoldEx模型重点强调了D可适应性标准(adaptablestandard)||的概念，是可适应性标准决定了某种细胞中每一种蛋白质的外向转运效率。该标准是由蛋白质氨基酸序列复杂的相互作用以及蛋白质折叠时所处的局部微环境(比如分子伴侣及帮助蛋白质折叠的酶、代谢产物、外向转运装置和ERAD装置等情况)等因素所决定的，而且该标准还可以在细胞处于应激环境时进行调整，帮助细胞适应相应的环境。各种不同的蛋白质都可以竞争这些细胞装置，结果导致某种蛋白的外向转运效率会取决于某一时刻表达的蛋白酶体的多少。FoldEx模型是第一个将蛋白质折叠相关以及内质网折叠活性、ERAD和外向转运装置相关热力学参数和动力学参数结合起来的理论模型，该模型将会是我们未来试验研究中的好帮手。大部分在内质网中合成的蛋白质多肽都会被N连接低聚糖(N-linkedoligosaccharides)修饰。低聚糖糖基转移酶(Oligosaccharyltransferase)能催化葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖( glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2oligosaccharides)与进入内质网蛋白所含的Asn-X-Ser/Thr基序中的天冬酰胺(asparagine)之间共价连接(图4)。这些N连接聚糖赋予了被修饰蛋白更多的亲水性，同时也能起到帮助蛋白质折叠的作用。而且，这些聚糖分子结构本身的修饰信息也能为我们提供当下的蛋白质的折叠状况信息。聚糖分子最外侧的两个葡萄糖分子会被内质网中的a葡萄糖苷酶(a-glucosidases)水解切除掉，以表明该蛋白正处于折叠过程之中(图4)。在这个阶段，葡聚糖依赖的分子伴侣蛋白会与该蛋白相连。在哺乳动物细胞中，钙联接蛋白(calnexin，是内质网中的一种磷酸化的钙结合蛋白)或钙网织蛋白(calreticulin)会与单葡糖基化修饰的糖蛋白(monoglucosylatedglycoproteins)相连接，帮助其成熟。当新生蛋白与这些伴侣蛋白分子解离之后，内质网内的a葡萄糖苷酶II(a-glucosidase-IItrims)分子会去掉残余的葡萄糖分子，防止新生蛋白再次与钙联接蛋白或钙网织蛋白相连。这些进行了正确折叠获得天然构象的糖蛋白随后就可以离开内质网了。但是那些需要更多帮助才能成熟的蛋白质又是如何获得正确构象的呢？作为哺乳动物细胞内质网内最主要的折叠装置，UDP葡萄糖(。DP-glucose)糖蛋白葡萄糖基转移酶(glycoproteinglucosyltransferase，GT或者叫UGGT)能识别出非天然蛋白质，并使其聚糖分子A分支重新葡萄糖基化，这样，就可以再次与钙联接蛋白或钙网织蛋白相连，进行重新折叠(图4b)。这种钙联接蛋白-钙网织蛋白循环(calnexinCcalreticulincycle)只是哺乳动物细胞内蛋白质质控系统里的第一步，但是如果新生蛋白D错过||了这一轮成熟的机会，就只能被降解掉。关于内质网的泛素化机制图4在酵母细胞和哺乳动物细胞内质网中对N连接聚糖分子的处理过程示意图。a：在酵母细胞和哺乳动物细胞中，寡糖基转移酶(oligosaccharyltransferase，OST)能将多萜醇载体上的葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子glucose3-mannose9-N-acetylglucosamine2oligosaccharide)转移到底物蛋白Asn-X-Ser/Thr基序中的天门冬酰胺残基上。在酵母细胞中葡萄糖苷酶1、2(glucosidases1and2，Gls1、Gls2)能将葡萄糖3-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子中最外侧的两个葡萄糖残基去除掉，形成葡萄糖1-甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(glucose1-mannose9-N-acetylglucosamine2oligosaccharide)，如图中步骤1所示。在Gls2蛋白的继续作用下最终能形成甘露糖9-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(mannose9-N-acetylglucosamine2oligosaccharide)，该分子能保护糖蛋白免遭降解，见步骤2。Mns1蛋白能去除聚糖分子B链，即中间链上最外侧的廿露糖残基，形成甘露糖8-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(mannose8-N-acetylglucosamine2oligosaccharide)，这说明该糖蛋白在内质网中停留了很长的一段时间，见步骤3。然后，Htm1蛋白继续处理最右手边的C链糖蛋白，形成甘露糖 7-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(mannose7-N-acetylglucosamine2oligosaccharide)，见步骤4；b：在哺乳动物细胞中，步骤1和2与酵母细胞中发生的相同，只不过在步骤2中由葡萄糖苷酶II(glucosidase-II)完成的去除A链中最后一个葡萄糖残基位点的反应是可逆的。葡萄糖基转移酶(Glucosyltransferase，GT)能促使那些未能获得天然构象的糖蛋白再次发生葡萄糖基化，见步骤3。如果EDEM蛋白被ERManI进行过度的去廿露糖基化处理或者被内质网降解，都会形成廿露糖5-N-乙酰葡萄糖胺2低聚糖分子(mannose5-N-acetylglucosamine2oligosaccharide)，而这就是蛋白质应该被降解的信号，见步骤4。2.给予降解信号那些没能获得天然构象的蛋白质必须被细胞降解，以免进行不必要的折叠，以免内质网被这些蛋白占据。D廿露糖计时器(mannosetimer)||模型认为，一旦蛋白质上的甘露糖残基被去掉，那么它就无法再获得正确的构象了。实际上，内质网中的糖基水解酶47(glycosylhydrolase-47，GH47)家族蛋白才是体内处理错误蛋白的第一道防线。在酵母细胞中，GH47家族里有两名成员在内质网中被发现，它们分别是a1,2廿露糖苷酶(a1,2-mannosidase)Mns1(该蛋白也被称为甘露糖苷酶样蛋白1)和甘露糖苷酶样蛋白Htm1，该蛋白是甘露糖苷酶1(mannosidase1)的同系物。Mns1蛋白能去除N连接聚糖B链上最外侧的廿露糖残基(图4)。实际上，这种修剪作用能影响到内质网中的所有糖蛋白，但是对糖蛋白的成熟过程和酵母细胞的存活都不会造成任何影响。不过如果细胞缺失了MNS1基因，那么对错误蛋白的处理能力就会被削弱，关于内质网的泛素化机制这说明在Mns1蛋白催化廿露糖9-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖(mannose9-N-acetylglucosamine2glycan)转变为甘露糖8-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖(mannose8-N-acetylglucosamine2glycan)之前，糖蛋白一直都被保护起来而免遭降解。因为Mns1蛋白是不考虑蛋白的折叠状态，对所有蛋白D一视同仁||的，由此可见，仅仅只靠8廿露糖结构是不足以促使糖蛋白降解的，一定还有其他的信号机制帮助细胞区分正常的蛋白与异常的蛋白。我们最开始认为Htm1蛋白只是一种凝集素蛋白(lectin)。但现在我们认为，糖蛋白在经过Mns1蛋白处理之后，Html蛋白可以去除掉N连接聚糖C链上的a1,2廿露糖帽结构(cappinga1,2-mannose)，不过我们目前还缺乏这方面的直接证据。因此，Mns1蛋白和Htm1蛋白之间的这种序贯作用最终就形成了甘露糖7-N-乙酰葡糖胺酶2结构(mannose7-N-acetylglucosamine2)，这种结构就是被ERAD所识别的信号。上述这种理论也可以解释为什么细胞缺失了编码a1,3廿露糖转移酶(a1,3-mannosyltransferase，Alg3)的基因之后细胞就可以在不需要Htm1蛋白的情况下仍然能对糖蛋白进行降解了。我们在△alg3细胞中发现，在N连接聚糖糖蛋白上有甘露糖5-N-乙酰葡糖胺酶2结构(mannose5-N-acetylglucosamine2)结构，该结构的末端仍然连接有由Htm1蛋白导致的a1,6廿露糖残基。Htm1蛋白是如何选择底物的我们还不清楚。不过Htm1蛋白可以和二硫化物异构酶(disulphideisomerase)Pdi1蛋白一起形成复合体，因此，Html蛋白可能只能对与氧化还原酶(oxidoreductase)有关的Pdil蛋白的底物发挥作用。在哺乳动物细胞中，我们在内质网中发现了GH47家族蛋白中的四名成员，即内质网a1,2廿露糖苷酶1(ERa1,2-mannosidase-I，ERManI)和其他三个廿露糖苷酶样蛋白EDEM1、EDEM2、EDEM3。ERManI蛋白与它在酵母细胞中的同源蛋白一样，也能水解a1,2廿露糖苷键，切掉B链上的一个廿露糖残基。内质网中ERManI蛋白的丰度能影响ERAD系统底物的稳定性。如果使用siRNA技术敲除掉ERManI蛋白，就会影响未被切割的无唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor)H2a蛋白前体的降解过程。如果过表达ERManI蛋白，则会增强去廿露糖基化作用(de-mannosylation)，降解掉a1抗胰蛋白酶(a1-antitrypsin)的无效变异体蛋白(nullHongkong(NHK)variant)。不过在酵母细胞中，仅靠ERManI蛋白还不足以对糖蛋白进行标记，使其降解。似乎ERManI蛋白还需要与EDEM家族蛋白共同作用才能处理掉异常的糖蛋白。虽然我们过去认为EDEM蛋白只是凝集素而已，但是现在已经年有证据表明EDEM家族蛋白与Htm1蛋白一样，都是甘露糖苷酶。细胞内EDEM1和EDEM3蛋白过表达时，连接在底物蛋白，诸如NHK、*****、T细胞受体a亚单位上的葡聚糖分子中廿露糖残基的数量就会减少。此外，根据我们对EDEM蛋白结构模型的分析，我们发现EDEM蛋白与ERManI蛋白在结构上具有惊人的相似性，而且还发现对于ERManI蛋白催化活性比较重要的氨基酸残基都非常保守。这说明至少EDEM1和EDEM3蛋白具有甘露糖苷酶的活性。不过我们还不清楚这些酶是如何选择各自底物的。但是我们知道EDEM1蛋白能与钙联接蛋白发生相互作用，因此，它可能借此方式来与底物糖蛋白发生相互作用。3.ERAD系统的分类整理功能被内质网内廿露糖苷酶I蛋白和Html蛋白处理过的折叠错误的糖蛋白最终必须由泛素连接酶进行泛素化修饰。但是未经糖基化修饰的异常蛋白也会经由上述途径进行降解，不过我们现在对起始过程还不清楚。背景知识2中对ERAD系统的主要底物进行了归纳总结。在蛋白的内质网腔、跨膜区域和胞质结构域里可关于内质网的泛素化机制能出现的各种蛋白质异常情况以及需要注意的出错情况，都使得该蛋白必须与E3连接酶不同，这些连接酶能与其它辅助因子一起形成复合体，招募固定末端折叠错误的蛋白质。背景知识2：ERAD底物简介al抗胰蛋白酶(al-Antitrypsin，al-AT)al抗胰蛋白酶是一种由肝细胞分泌的可溶性糖基化丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine-proteaseinhibitor)。NHK变异体蛋白基因具有一提前出现的终止密码子。虽然NHK变异体蛋白不能进行正常的折叠，但是它们也能部分的D逃脱||内质网中蛋白质质控系统的监测，被细胞分泌出来。NHK-QQQ蛋白是一种未被糖基化修饰的人工NHK蛋白。在PiZ变异体中，蛋白质第342位的谷氨酸突变成了赖氨酸，这会影响到蛋白质的折叠，并使其无法分泌。在某些情况下，PiZ蛋白会积聚在内质网中，形成肝硬化。如果人体缺乏al抗胰蛋白酶还会导致肺气肿(lungemphysema)，这是由于在缺乏al抗胰蛋白酶时嗜中性白细胞分泌的弹性蛋白酶活性会增高，从而破坏了肺泡间的结缔组织(connectivetissue)结构。ASGPRH2aASGPRH2a是唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoproteinreceptor)的组成亚单位。唾液酸糖蛋白受体能以受体介导的胞吞作用(receptor-mediatedendocytosis)清除循环中不含唾液酸的糖蛋白。*****B分泌酶叩-secretase，BACE)在胰腺中的同工酶，它无法帮助处理淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein)。相反，*****自己会被降解。CD35和TCRa属于T细胞受体家族，能在内质网中组装。孤儿亚单位(Orphansubunits)会被降解。同样，分泌型Ig-^在缺乏轻链的情况下也会被降解。囊性纤维病电导调节因子(conductanceregulator，CFTR)CFTR是由上皮细胞表达的一种氯离子通道蛋白。AF508突变型蛋白是最常见的导致囊性纤维病这种遗传性常染色体隐性遗传病的病因oAF508缺失突变型蛋白只能部分影响氯离子通道的生理活性，但是该变异蛋白的成熟过程会受到很大的影响。上皮细胞由于缺乏氯离子，因此渗透压不足，细胞内产生的粘液含水量也就相应降低。高粘度的粘液影响了患者气道的自净功能，导致持续性的气道感染，最终引起肺部纤维性变，肺功能衰竭。羧肽酶Y(carboxypeptidaseY,CPY)羧肽酶Y是酿酒酵母空泡中的一种可溶性丝氨酸蛋白酶，它携带有N连接聚糖。CPY*蛋白是CPY蛋白第255位的甘氨酸突变为精氨酸的突变体蛋白。CPY*蛋白的C末端缺乏低聚糖分子，因此无法被ERAD途径识别。6-羟邛-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoAreductase)又名3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoAreductase)该酶是一种膜锚定蛋白质，也是甲羟戊酸(mevalonate)代谢通路中的限速酶。它的稳定性与细胞内甾醇的丰度高度相关。当甾醇含量足够高时，该酶会被降解。IgKLCNSIgKLCNS是一种无法转运的免疫球蛋白轻链蛋白，会被ERAD途径降解。KAI1又名CD82KAI1蛋白属于四次跨膜蛋白家族(tetraspaninfamily)。在好几种人类癌症中都会发现KAI1蛋白表达量降低与肿瘤转移能力增强有关。MHCI类分子MHCI类分子能将细胞内的肽段呈递给T细胞，以便机体清除表达外源性肽段的细胞。HCMV病毒借助细胞ERAD系统能降解MHCI类分子的重链蛋白，以防止细胞呈递病毒来源的肽段。Pael受体(Paelreceptor，Pael-R)Pael受体是泛素连接酶Parkin的底物蛋白。当Parkin失活时，未经折叠的Pael受体会聚集在内质网中，导致神经细胞死亡。这说明Pael受体在青少年帕金森氏病(juvenileParkinson'sdisease)这种常染色体隐性遗传疾病中扮演了重要角色。关于内质网的泛素化机制Pdr5Pdr5蛋白是一种ATP结合盒式转运体蛋白(ATP-bindingcassettetransporter)，它能使酿酒酵母对多种药物产生抗性。内质网核糖体结合糖蛋白(RibophorinI)内质网核糖体结合糖蛋白是寡糖基转移酶复合体(oligosaccharyltransferasecomplex)中锚定在膜上的亚单位。如果去掉该蛋白的C末端跨膜结构域就会形成错误折叠的，可溶性的变异体蛋白RI322,该变异体蛋白只携带有一个N连接聚糖。甲状腺素转运蛋白(Transthyretin，TTR)甲状腺素转运蛋白是由肝细胞分泌的未被糖基化修饰的血清蛋白，它能起到转运甲状腺素的作用。如果该蛋白发生突变，会破坏它所构成的同源四聚体结构的稳定性，形成淀粉样纤维蛋白，最终导致神经细胞变性，器官功能衰竭。3.1针对各种不同异常情况的蛋白需要不同的途径给予解决在酵母细胞中两种E3连接酶，但是这两种酶就足以处理大部分的底物蛋白。连接酶Doa10蛋白是由Mat-a2C10蛋白降解而来，它主要负责处理胞质结构域发生问题的蛋白质，而另一种连接酶，6-羟邛-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-CoAreductase)的降解产物HRD蛋白则负责处理腔内结构域或跨膜结构域异常的蛋白质。为了突出这种处理方式上的差异，有人对ERAD系统的概念进行了扩展，提出是ERAD-C负责降解胞质结构域发生问题的蛋白质，ERAD-M负责降解跨膜结构域发生问题的蛋白质，而ERAD-L负责降解内质网腔内结构域发生问题的蛋白质。这三条处理途径的D起点||不同，但D终点||却都汇聚到胞质当中。兼有多种异常情况的蛋白质首先会由ERAD-C途径处理，因为该途径的处理速度似乎要比其他两条途径快。不过我们需要注意的是，我们上述的这三种ERAD途径只是针对酵母细胞中的蛋白质情况而言，不一定能推广使用。3.2酵母细胞中ERAD系统的关键信息HRD连接酶是锚定在内质网膜上的蛋白复合体，它至少由5个不同的亚基组成。Hrd1/Der3蛋白具有6个跨膜结构域，以及一个胞质内环-指结构域（RING-fingerdomain）,该结构域可以使泛素连接酶的靶蛋白泛素化。Hrd1蛋白能与Usa1蛋白发生相互作用，而Usa1蛋白是Der1蛋白（在ER-1中被降解）的配体。HRD蛋白复合体的腔内结构域是由Hrd3蛋白和Yos9蛋白（酵母细胞OS-9蛋白的同系物）组成的。Yos9蛋白携带有甘露糖6磷酸盐受体同源性结构域（mannose-6phosphatereceptorhomology，（MRH）domain），该结构域能够识别由Htm1蛋白催化产生的，在末端包含有a1,6连接廿露糖（a1,6-linkedmannose）的N连接聚糖分子。如果MRH结构域发生突变，Yos9蛋白就无法与N连接聚糖结合，结果CPY*蛋白（即第255位廿氨酸突变为精氨酸的CPY蛋白）和其他糖蛋白发生降解，这说明Yos9蛋白能够将异常蛋白的识别过程与泛素-蛋白酶体系统联系起来。但是如果去掉Yos9蛋白，或者去掉CPY大蛋白上的糖基化位点，却并不足以破坏HRD连接酶与其底物之间的相互作用。那么如果不是为了与底物进行结合，Yos9蛋白和CPY大蛋白上的聚糖分子又到底起到了一种什么样的作用呢？ Yos9蛋白中的MRH结构域可能能对所有待查蛋白进行搜索、筛选，看看它们是否都携带有尚未与其他蛋白形成稳定相互作用的甘露糖7-N-乙酰葡糖胺酶2低聚糖（mannose7-N-acetylglucosamine2glycan）位点。而复合体中的其他组成蛋白质则可以与折叠错误的蛋白质形成连接。实际上，Hrd3蛋白的确能与异常蛋白相连，而且对疏水蛋白具有较高的亲和力。Hsp70蛋白分子伴侣Kar2蛋白(karyogamy2)也能与Yos9蛋白相连，这说明HRD连接酶的腔内结构域可以通过多种方式与异常蛋白发生相互作用。关于内质网的泛素化机制HRD复合体是依靠何种机制选择出那些机体不需要的异常蛋白，将其D清理||出内质网的呢？我们又提出了下列机制，在Kar2的作用下，非天然构象的蛋白质与HRD连接酶发生相互作用，最终，这些非天然构象的蛋白质可能会形成成熟的，具有正确折叠构象的蛋白质，或者仍然无法形成正确构象。然后，Hrd3蛋白可能会通过底物蛋白中的疏水结构与底物蛋白结合，同时，Yos9蛋白会对这些底物蛋白进行筛查，检查它们是否具有末端a1,6连接廿露糖(a1,6-linkedmannose)。只有能同时与Yos9蛋白和Hrd3蛋白发生相互作用的底物蛋白才能在携带有甘露糖8-9聚糖分子(mannose8C9glycans，这些糖基化位点可以被切除，帮助蛋白质形成正确的折叠)的糖蛋白的帮助下，经由Hrd1蛋白被泛素化途径修饰。如果在细胞内缺乏Yos9蛋白和Hrd3蛋白的情况下过量表达Hrd1蛋白，会导致内质网内的蛋白广泛性降解，这说明Yos9蛋白和Hrd3蛋白能起到筛选的作用，以保证只有合适的底物才能进入胞质溶胶经由泛素化途径被降解。为了达到这个目的，Hrd1蛋白会与可溶性的E2结合酶Ubcl和Ubc7一起协同发挥作用，这些E2结合酶会通过Cuel蛋白被锚定在内质网膜上。在酵母细胞中第二个位于内质网膜上的E3连接酶是DoalO蛋白，我们是在筛选能够降解可溶性转录抑制因子Mata2的蛋白因子的过程中发现DoalO蛋白的。随后我们又发现了好几个DoalO蛋白的膜上底物蛋白，因此认为DoalO蛋白也参与了ERAD通路。DoalO蛋白在N端具有特征性的指环结构域（RING-fingerdomains）以及14个跨膜结构域。虽然DoalO蛋白复合体的膜结构如此复杂，但是组成DoalO蛋白复合体的亚单位还是非常简单的，我们现在只发现E2结合酶Ubc6蛋白和Ubc7蛋白是DoalO蛋白的辅因子。Ubc7蛋白是通过Cuel蛋白被锚定在内质网膜上的。3.3哺乳动物连接酶我们在哺乳动物细胞中发现了更多的参与ERAD系统的连接酶，要比酵母细胞中发现的连接酶多得多。有两种与酵母细胞Hrdl蛋白同源的哺乳动物蛋白 HRD1蛋白，又名Synoviolin蛋白；和gp78蛋白，又名AMFR蛋白，即肿瘤自分泌活性因子受体蛋白（tumourautocrinemotilityfactorreceptor）。HRD1蛋白与人Hrd3同源蛋白SEL1L（Lin12样蛋白抑制蛋白）、HERP蛋白（与酵母细胞中的Usal蛋白类似）、Derlin1C3蛋白（属于Derl家族蛋白）和OS-9蛋白（Yos9蛋白的人类同源蛋白，可见于骨肉瘤细胞)一起，形成了与酵母HRD连接酶复合体相似的哺乳动物连接酶复合体。哺乳动物细胞表达两种OS-9蛋白即OS-9.1蛋白及其变异蛋白OS-9.2蛋白(该蛋白相比OS-9.1蛋白缺乏55个氨基酸残基)。这两种蛋白都能与SEL1L蛋白发生相互作用，也能与不具有正确构象的al抗胰蛋白酶(a1-antitrypsin)的变异蛋白NHK相结合。与它们的酵母同源蛋白Yos9一样，OS-9蛋白与底物蛋白之间的结合也不需要N连接聚糖分子的参与，所以它们可以和未被糖基化修饰的NHK蛋白——NHK-QQQ蛋白相结合。但是如果底物蛋白缺乏糖基化修饰，它们就无法被细胞降解。通过siRNA降低OS-9蛋白的表达水平会影响细胞内NHK蛋白的降解，增加NHK蛋白的分泌水平。而过表达OS-9蛋白则会抑制NHK蛋白的分泌，但是不会增强它们的降解水平。OS-9蛋白可能会起到两种作用，生理浓度水平的OS-9蛋白可以与SEL1L蛋白协作，将构象不正确的异常蛋白降解；而过量的高水平的OS-9蛋白却无法与HRD连接酶发生相互作用降解异常蛋白。Yos9蛋白在哺乳动物细胞中的另一个同系物(orthologue)就是XTP3-B蛋白，即XTP3反式激活蛋白B(XTP3-transactivatedproteinB)，也被称为Erlectin蛋白。XTP3-B蛋白具有两个MRH结构域，能与SEL1L蛋白发生相互作用。与OS-9蛋白一样，XTP3-B蛋白也能与NHK蛋白及其非糖基化的变异体蛋白相结合。如果过量表达XTP3-B蛋白会影响其底物蛋白的降解过程，不过通过siRNA技术减少XTP3-B蛋白的表达关于内质网的泛素化机制量却没有对NHK蛋白的稳定性造成任何影响。我们还没有发现XTP3-B蛋白的最适底物，XTP3-B蛋白也可以使未成熟的蛋白质滞留在内质网中，并防止它们聚集，这一点与OS-9蛋白过表达时的情况一样。HRD1蛋白能避免细胞在遭受应急刺激信号时进入凋亡途径，这说明它在内质网异常蛋白的泛素化修饰过程中起到了非常广泛的作用。在目前为止发现的所有HRD连接酶的底物蛋白中，有一些是名为RI332的内质网核糖体结合糖蛋白(Ribophorin)的截短体蛋白和折叠错误蛋白，有一些是未组装的分泌型Ig^单链蛋白以及未糖基化的IgK轻链蛋白变异体蛋白。在内质网中，这种异常IgK轻链蛋白处于一种完全氧化的状态，具有两个二硫键(disulphidebonds)，而部分还原时只具有一个二硫键。只有这种部分还原的异常IgK轻链蛋白能与Derlin-1蛋白和HERP蛋白发生相互作用，这表明在完全氧化的IgK轻链蛋白被连接酶招募之前，已经有一个二硫键被还原了。人巨细胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)基因编码产物特异性小区域蛋白11(uniqueshortregionprotein11，US11)也能与HRD连接酶复合体的组成单位SEL1L蛋白和Derlin-1蛋白相互合作，降解MHCI类分子重链蛋白。Gp78蛋白和人HRD1蛋白的跨膜结构域具有超过50%的序列同源性。与需要Cuel帮助才能与Ubc7发生相互作用的Hrd1蛋白不同，gp78蛋白除了环指结构域之外还具有G2BR结构域，该结构域可以与UBE2G2进行结合，因此可以直接招募酵母细胞中Ubc7蛋白的同系物E2UBE2G2蛋白，即E2结合酶E2G2。在gp78蛋白的底物蛋白中有一个底物是al抗胰蛋白酶的变异体PiZ蛋白，还有T细胞受体orphan亚单位，比如TCRa和Cd35等。而且，gp78蛋白还能泛素化修饰HMG-CoA还原酶，这说明ERAD系统在固醇代谢途径中的作用非常保守。gp78蛋白还有另一个具有非常重要医疗价值的底物，即KAI1蛋白，该蛋白具有四个跨膜结构域，能够抑制肿瘤转移。如果通过siRNA降低gp78蛋白的表达水平，会增加细胞内KAI1蛋白的含量，降低肿瘤细胞的转移能力。Doa10蛋白在哺乳动物细胞中最有可能的同系物就是TEB4蛋白。这两种蛋白都有相同的跨膜结构域和N末端的指环结构域。不过TEB4蛋白可以使其自身泛素化，但是我们还没有发现它的底物蛋白。除了这些与酵母细胞连接酶相似的连接酶之外，在哺乳动物细胞中还存在一些酵母细胞中没有的ERAD连接酶。内质网中有一种名为携带有膜锚定结构的指环蛋白1(RING-fingerproteinwithmembraneanchor1,RMA1)，该蛋白是一种在拟南芥(Arabidopsis)到人类中都广泛存在、非常保守的泛素连接酶。RMA1蛋白能与UBE2J1蛋白相互作用，如果过表达RMA1蛋白会降低细胞内囊性纤维化病跨膜传导调节蛋白(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，CFTR)的水平。RMA1蛋白最主要的作用是在CFTR蛋白翻译过程中或翻译刚刚完成之后检测CFTR蛋白N末端结构域的折叠情况。翻译完成之后，胞质内的E3连接酶CHIP蛋白会促使RMA1蛋白解离，继续检测CFTR蛋白的折叠情况。CHIP蛋白含有一在结构上与指环结构域非常类似的U盒子(U-box)结构域，它是一三角形四肽(tetratricopeptide)重复结构域，能与Hsp70蛋白和Hsp90蛋白发生相互作用。CHIP蛋白这种能与分子伴侣蛋白和泛素连接酶蛋白相结合的活性表明CHIP蛋白能监控Hsp70蛋白介导的蛋白折叠过程，并能降解那些发生了不可逆的错误折叠的蛋白质。另一个能与RMA1蛋白发生相互作用的蛋白是B细胞受体相关蛋白31(B-cellreceptor-associatedprotein31，BAP31)。BAP31蛋白是一种膜内在蛋白质(integralmembraneprotein)，它也参与了对内质网内膜蛋白的分选工作。BAP31蛋白能与Sec61孔蛋白、E3连接酶RMA1蛋白、Derlin-1蛋白等发生相互作用。如果通过siRNA技术抑制BAP31蛋白的表达则能够稳定CFTR蛋白，BAP31蛋白还能起到分子伴侣的作关于内质网的泛素化机制用，帮助新合成的CFTR蛋白折叠，还能帮助区分各种不能由RMA1蛋白折叠以及由Derlin-1蛋白降解的变异蛋白。泛素连接酶蛋白的变异体蛋白Parkin与青少年帕金森氏病(juvenileParkinson'sdisease)有关。如果表达缺陷型的Parkin蛋白可以导致Pael-R蛋白在内质网中聚集，继而导致多巴胺能神经元变性，形成帕金森氏病。在体外，Parkin蛋白可以泛素化修饰Pael-R蛋白，不过效率非常低，但是在CHIP蛋白的帮助下可以大大提高此泛素化修饰效率。胞质内的SCF复合体是由Skpl蛋白、Cull蛋白、Roc1蛋白(又名Rbxl蛋白)以及F-Box等蛋白组成的泛素连接酶复合体。在大量的F-Box蛋白中有两个蛋白能够决定SCF连接酶的底物特异性，这两个蛋白是神经元特异性的蛋白Fbsl和Fbs2,它们都是能够识别糖基侧链的F-Box蛋白。Fbsl蛋白和Fbs2蛋白都含有糖基化位点结合结构域，能与N连接聚糖分子中最内侧的糖基化位点相结合。我们目前还没有发现SCF复合体的底物，但它们可以清除那些可能是从经典的ERAD途径中D逃脱||的糖蛋白胞质溶胶或者是在内质网脂质双分子膜破裂时D泄露||出来的糖蛋白。3.4跨越内质网膜结构在折叠发生错误的蛋白质被泛素化修饰以及降解之前，它们必须能够跨越内质网膜结构。这种外向转运过程包括转位(dislocation)和逆移位(retrotranslocation)两种过程。但是我们现在还不清楚蛋白质是如何被转运出内质网的，可能是通过Sec61易位子(translocon)以一种类似于转入过程(importprocess)的方式来完成的，也可能是通过形成脂质小体(lipiddroplet)的方式来完成的。HRD连接酶将发生在内质网膜两侧的重要事件联系了起来。这两个重要事件分别是在内质网腔内侧发生的底物蛋白募集事件和在内质网胞质侧发生的底物蛋白质泛素化修饰事件。因此，底物蛋白质的外向运输事件可能是通过连接酶中的某种D管道||完成的。可能HRD复合体本身就能将异常的蛋白质D排出||到胞质当中。与HRD连接酶共同发挥作用的还有Derlin家族蛋白，这些Derlin家族蛋白也是最有可能起到转运作用的蛋白质。有3个Derlin家族蛋白与酵母Deri蛋白具有一定程度的同源性，这3个蛋白可以一起组成异源复合体，同时MHCI类重链分子也参与了该复合体的形成。Derlin-1蛋白能与HCMV病毒的US11蛋白发生相互作用。当我们使用抑制剂抑制蛋白酶体活性的时候，我们发现Derlin-1蛋白与去糖基化的重链分子结合在一起。而胞质中的N聚糖酶(N-glycanase)能去除掉MHCI类重链分子上的糖基化位点。因此，Derlin-1蛋白肯定是在重链分子被转运至胞质中之后或者在转运过程之中才与其结合的。我们还发现具有各种不同功能的ATP酶，比如AAA+-ATPasep97蛋白(即酵母细胞中的Cdc48蛋白)等能够与Derlin-1蛋白和Derlin-2蛋白发生相互作用，这也都说明Derlin蛋白能够起到转运内质网中异常蛋白的作用。我们在下面还将讨论到，Cdc48蛋白能促使ERAD系统底物锚定到内质网膜上。Derlin-1蛋白不参与US2蛋白介导的重链分子降解过程，因此它可能还会起到其他的作用，或者在内质网中还存在其他的转运机制。3.5底物蛋白从内质网膜结构上释放出来并被降解破坏异常蛋白穿越内质网膜结构的过程需要有一种D力||来指引转运的方向。而且，底物蛋白必须从膜结构中释放出来才能进入蛋白酶体。转运和释放过程都需要能量，而且这两个过程可能是偶联在一起的。还有一部分能量需要参与底物蛋白的泛素化修饰过程，该过程也是底物蛋白易位的先决条件。另一个需要能量的过程是由Cdc48蛋白(在人类细胞中是p97蛋白)介导的°Cdc48蛋白这种AAAATP酶可以形成同源六聚体(homohexamers)，在泛素蛋白融合降解蛋白((ubiquitinfusiondegradation1，Ufdl)和核定位蛋白4(nuclearproteinlocalization4Npl4)等辅助因子的共同作用下使异常蛋白从内质网膜上解离下来。不关于内质网的泛素化机制过这其中的具体分子机制我们暂时还不清楚。根据D分子钳(molecularratchet)||模型，ATP水解循环可以导致Cdc48蛋白复合体内部构象改变，从而促使结合在p97蛋白N末端的底物蛋白从内质网膜上释放下来。而另一种模型则认为，在Cdc48蛋白复合体富含精氨酸的环状结构形成的富含胍基(guanidyl)的环境中会产生一个D变性圈(denaturationcollar)||结构，该结构可以通过变性作用使蛋白打开折叠。Cdc48蛋白复合体需要固定在内质网膜上才能对底物蛋白施加作用。结果，Cdc48蛋白复合体以一种需要泛素化修饰底物蛋白的方式与膜锚定蛋白Ubx2的泛素蛋白调节结构域X(ubiquitinregulatoryX，UBX)发生相互作用。在哺乳动物中具有与Cdc48蛋白复合体类似功能的蛋白可能是UBXD2或ERASIN蛋白。当底物蛋白被泛素化修饰并从内质网膜结构上解离下来之后，它们会在辐射敏感蛋白23(radiationsensitive23，Rad23)和Karl蛋白抑制蛋白(ominantsuppressorofKarl，Dsk2)的作用下被转运至蛋白酶体。这些同源性适配体蛋白的C末端都具有泛素相关基序(ubiquitin-associatedmotif，UBA)，能与多泛素蛋白链相结合，同时也在N端具有一泛素样结构域(ubiquitin-likedomain，UBL)，能指引适配体蛋白和底物蛋白进入蛋白酶体，蛋白酶体可以通过RpnlO和Rpn13亚单位识别多泛素化修饰的底物蛋白。此外，Dsk2蛋白和Rad23蛋白还可能保护多泛素蛋白侧链免遭泛素蛋白水解酶的降解作用。在这条经典的途径中，E3连接酶能多泛素化修饰底物。在酵母细胞中还有第二条途径，底物蛋白首先在连接酶的作用下被单泛素化修饰或者被双泛素化修饰，然后在U-Box蛋白Ufd2和Cdc48蛋白的作用下延长泛素链。Cdc48蛋白能限制Ufd2蛋白对泛素链的延长作用，因为Ufd2蛋白能添加4至6个泛素蛋白，这已经足以供Rad23蛋白和Dsk2蛋白进行识别了。这种泛素修饰侧链的延长作用可能就起到了指引底物蛋白进入蛋白酶体的作用。因为N聚糖酶能与Rad23蛋白发生相互作用，也有可能与其他ERAD组成单位发生相互作用，因此糖蛋白在到达胞质时就会失去寡聚糖修饰分子。不过该过程对蛋白的降解过程不会产生影响，但是去掉了这些大分子侧链之后会促进底物蛋白进入蛋白酶体中的活性位点。在被蛋白酶体降解之前，去泛素化酶会去除掉底物蛋白上的泛素修饰分子，这些泛素修饰分子随后会被再循环利用。4.调整内质网的蛋白质折叠和降解能力环境改变和发育过程都会使内质网的D任务||发生很大的改变。为了维持内质网的内环境稳定状态，还有一套名为未折叠蛋白反应机制(unfoldedproteinr