遗传学新版课件 15

CHAPTER15GeneRegulationInEukaryotes1.cis-actingandtrans-actingelementsDNAsequencesthatserveasattachmentsitesforDNAbindingproteinsGeneslocatedsomewhereotherthanatthetargetgene

ThethreeRNApolymerasesofeukaryoticcells

Basalfactorsbindtopromoters

ofallprotein-encodinggenesTBP:TATAbox–bindingproteinTAF:TBP-associatedfactors

Transcriptionalactivators

bindtospecificenhancersMostactivatorproteinsfunctioninthecellasdimers

Repressorproteinsreducetranscriptionallevelsthroughcompetitionorquenching

Thesametranscriptionfactors

canplaydifferentrolesindifferentcells

TheMyc-Maxsystemofaactivation

andrepression(Burkitt’slymphoma)

Max-Maxhomodimer,transcriptionandcellproliferationinhibitedMyc-Maxheterodimer,transcriptionandcellproliferationLocalizationofactivatordomains

withrecombinantDNAconstructs

TheYeastGAL(galactose)System

3genesarecontrolledbythesameenhancerActivatorGAL4bindstothisenhancer,butitsactivityisquenchedbyGAL80GalactosebindstoGAL1andGAL3,allowthembindtoGAL80,activationoftheGAL1,GAL7andGAL10

Inducible2.InductionofTranscriptionalActivitybyEnvironmentalandBiologicalFactorsTemperature:33℃TheHeat-shocktranscriptionfactoractivated

Temperature:Theribulose1,5bisphosphatecarboxylasegenesinplants（核酮糖1,5-二磷酸羧化酶）

Light:3.RNAProcessing

ControlledTranscriptionofDNA

AlternateSplicingofRNA:

e.g.1Therattroponin（肌钙蛋白）Tgene

e.g.2ThesexlethalgeneinDrosophila

AlternateSplicingofRNA:DifferentialRNASplicing

4.RNAStability:

TransferrinreceptorlevelsareregulatedbyintracellularironconcentrationIRE---ironresponseelementsIRE-BP---IREbindingprotein

5.SignalMolecules:

GenesThatRespondtoSteroidHormones

Regulationofgeneexpression

bypeptidehormones

6.Epigeneticsregulation

-表观遗传学调控Epigeneticsreferstoheritablealterationsingeneexpressionthatdonotentailchangesinnucleotidesequence.表观遗传学是指不需要核苷酸序列变异的基因表达的可遗传改变。

ConceptofEpigenetics基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。表观遗传差异：同卵双生

表观遗传变异是如何实现的？

Epigeneticeffectscanbecomplishedbyseveralself-reinforcingandinterrelatedcovalentmodificationsonDNAand/orchromosomalproteins,suchasDNAmethylation

andhistonemodifications,andbychromatinremodeling,suchasrepositioningofnucleosomes.Theseheritablemodificationsarecollectivelytermed“epigeneticcodes”(reviewedinRichardsandElgin,2002).

表观遗传调控机制DNA甲基化

DNAmethylation组蛋白共价修饰

Covalentmodificationsinhistone染色体重塑

Chromatinremodeling非编码RNA调控

NonsenseRNA基因表达重新编程

Reprograming

(1)DNAmethylationDNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶（DNAmethyltransferase,DNMT）的作用下，将一个甲基添加在DNA分子的碱基上，最常见的是加在胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC)。5mC占胞嘧啶总量的2%-7%，约70%的5mC存在于CpG二连核苷。结构基因含有很多CpG结构，基因组中60%～90%的CpG都被甲基化,未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛,位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。

InheritanceofmethylationstatesCpGIslandDNAMethylation

CpGIslandDNAMethylation

DNA甲基转移酶的类型及功能DNMT1在细胞分裂过程中维持DNA复制时新生链的甲基化状态与方式。DNMT2与DNA特异位点结合，但其作用还不清楚，从结构上说DNMT2仅仅含有催化区域，而缺失整个调节区域。

DNMT3a和DNMT3L催化DNA甲基化新生位点，DNMT3a/DNMT3L对着丝粒卫星DNA重复序列甲基化。

DNA甲基转移酶DNMT1,DNMT3a和DNMT3LDNA甲基化的功能DNA甲基化可引起基因组中相应区域的染色质结构变化,使DNA失去DNA酶的敏感位点和限制性内切酶的切割位点；DNA甲基化可使染色质高度螺旋化,凝缩成团,失去转录活性。

DNA甲基化的意义宿主防御模型转座子的活性对机体非常有害甲基化抑制转座子的活性基因调控模型DNA甲基化的主要功能是转录沉默建立特定的基因表达模式：组织特异性、生殖特异性…基因印记、X染色体失活

①直接干扰特异转录因子和各种启动子识别位点的结合；②甲基化的DNA结合转录抑制因子引起基因沉默；③通过影响核小体的位置或与其染色体蛋白质相互作用而改变染色体的结构，介导转录抑制；④eCP2(甲基化的CG序列结合蛋白)C端的转录抑制区域(TRD)与Sin3A结合以及恢复组蛋白脱乙酰化酶(histonedeacetylase，HDAC)活性去修饰染色质，使基因转录失活，MeCP2的TRD还可以与TFⅡB结合抑制转录。

目前，有4种可能机制解释DNA甲基化对转录的抑制：DNA甲基化对转录的抑制机制ThefullyunmethylatedstateofapromoterCpGislandisassociatedwithtranscriptionalactivity.Densemethylationcausestranscriptionalsilencing.

CpGIslandMethylationandTranscription甲基化也是一个可逆的过程基因调控元件(如启动子)所含CpG岛中的5-mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合，所以DNA甲基化(DNAmethylation)一般与基因沉默(genesilence)相关联非甲基化(non-methylated)一般与基因的活化(geneactivation)相关联去甲基化(demethylation)往往与一个沉默基因的重新激活(reactivation)相关联。CpGIslandDNAMethylation

DemethylationandDeacetylationTrichostatin---曲古抑菌素，组蛋白脱乙酰化酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine---5-杂氮-2脱氧胞苷，甲基化抑制剂

5-aza-dCinductionofBNIP3geneexpressionDetectionofmethylatedCpGislandsBisulfite-PCRmethodDistinguishingnormalcytosinefrom5-methyl-cytosine亚硫酸氢盐处理(2)genomicimprinting

(基因组印记)

基因在世代传递过程中，由于DNA的甲基化作用，来源于父母本的等位基因会有不同的表现。个体表现出上代遗传下来的基因组印记的效应。就好像被打上了父母的印记一样。但是，被打上父母印记的基因在生殖细胞形成时，印记会被抹去，重新打上自己的印记。印记基因（imprintinggene）遍布于整个基因组，印记基因内含子较小，基因组织表达有特异性。人类基因组约有100多个印记基因。

GenomicImprintingreferstothespecificsilencinganddifferentialexpressionofthetwoallelesofagenedependingonwhethertheywereinheritedthroughanovocyteoraspermatocyte.DNAmethylationhasbeendemonstratedtobeessentialfortheexpressionofalmostallimprintedgenesanditappearsthatlossoftheDNAmethylationresultsinactivationofthesilentalleleofthesegenes,whichissilencedinnormalconditions,andsuchmodificationisusuallylocalizedtoregionscalleddifferentiallymethylatedregions(DMRs).

GenomicImprintingi概念基因印记（geneimprinting)是指基因组在传递遗传信息的过程中，通过基因组的化学修饰（DNA的甲基化；组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等）而使基因或DNA片段被标识的过程。基因组印记依靠单亲传递某种性状的遗传信息，被印迹的基因会随着其来自父源或母源而表现不同，即源自双亲的两个等位基因中一个不表达或表达很弱。不遵循孟德尔定律，是一种典型的非孟德尔遗传，正反交结果不同。

正交Igf-2Igf-2Igf-2mIgf-2mIgf-2Igf-2Igf-2mIgf-2m反交♂♀正常小鼠矮小型小鼠矮小型小鼠矮小型小鼠正常小鼠正常小鼠Igf-2mIgf-2Igf-2Igf-2m♂♀

Insulin-likegrowthfactor2(Igf2)43由正反交实验可以看出：印记基因的正反交结果不一致、不符合孟德尔定律。小鼠Igf-2

基因总是母本来源的等位基因被印记，父本来源的等位基因表达，因此是母本印记。基因印记使基因的表达受到抑制，导致被印记的基因的生物功能的丧失。

正反交实验Methylationofimprintinggene

ii主要功能出生前的生长发育;父系基因的表达-胚胎发育能力增强母系基因的表达-胚胎发育能力削弱在特定细胞系及神经发育方面有重要功能

印记去除（去甲基化）印记形成（重新甲基化）印记维持（甲基化维持）父源基因组的去甲基化是将甲基直接去除；而母源基因组的去甲基化则多数是因甲基转移酶DNMT1活性受阻而使甲基化维持失败。

iii印记过程

Establishmentofimprintinggene

iv遗传印记的特点遗传印记遍布基因组印记基因的内含子小，雄性印记基因重组率高于雌性印记基因印记基因表达具有组织特异性印记基因在世代传递中可以逆转

v印记基因的调控方式母源等位基因簇e.g.H19的基因印记簇对Igf2基因采用ncRNA介导的沉默机制父源等位基因簇e.g.Igf2的基因印记簇对H19基因采用基于绝缘子的沉默机制

InsulatorElementsBlocktheActivityofNearbyEnhancers父源等位基因簇和母源等位基因簇DMR:differentiallymethylatedregion;MBD:methyl-CpGbandingdomainCTCF：CCCTC-bandingfactor甲基化CpG岛非甲基化CpG岛

RegulationofimprintinginIgf2-H19locusDMR:differentiallymethylatedregionICR：imprintcontrolregion(3)CovalentModificationsinHistone

Histone(组蛋白)

组蛋白修饰乙酰化--一般与活化的染色质构型相关联，乙酰化修饰大多发生在H3、H4的Lys残基上。甲基化--发生在H3、H4的Lys和Asp残基上，可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的位置和程度。磷酸化--发生于Ser残基，一般与基因活化相关。泛素化--一般是C端Lys修饰，启动基因表达。SUMO（一种类泛素蛋白）化--可稳定异染色质。其他修饰

CovalentModificationsinHistone

CovalentModificationsinHistone

i组蛋白的乙酰化位点：通常发生在蛋白质的赖氨酸(K)上；可逆的生化反应：乙酰化和去乙酰化分子效应：中和赖氨酸上的正电荷，增加组蛋白与DNA的排斥力，使DNA结构变得疏松，从而导致基因的转录活化。生物学功能：

A.基因转录活化；B.DNA损伤修复

AcetylationinhistoneAcetylationanddeacetylationinhistone

DemethylationandDeacetylationTrichostatin---曲古抑菌素，组蛋白脱乙酰化酶抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine---5-杂氮-2脱氧胞苷，甲基化抑制剂

Acetylation/deacetylation

inhistone组蛋白乙酰化也是一可逆的动态过程。组蛋白乙酰基转移酶(HAT)将乙酰辅酶A乙酰基部分转移到核心组蛋白氨基末端上特定赖氨酸残基的ε2氨基基团。这些赖氨酸的乙酰化导致电荷的中和以及DNA与组蛋白的分离,使核小体DNA易于接近转录因子。在此种情况下,其他因子就可乘虚而入结合于DNA上。组蛋白乙酰化的影响:

染色质是由DNA双链缠绕组蛋白及非组蛋白形成。组蛋白乙酰化后染色体处于开放状态有利于转录，且与乙酰化的组蛋白相联的DNA片段上的基因活化；反之，组蛋白脱乙酰化可使基因表达沉默

研究表明，组蛋白甲基化可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的赖氨酸处于什么位置。

例如，组蛋白H3Lys9甲基化最终导致了基因的沉默；然而，位于H3Lys4的甲基化则与基因的活化相关联。

ii组蛋白的甲基化位点：主要发生在赖氨酸(K)或精氨酸(R)上；分子效应：

增加赖氨酸上的疏水力生物学功能：

A.基因转录活化（H3-K4)；B.基因转录沉默（H3-K9）；C.X染色体失活

MethylationinhistoneDNMT:DNAmethyltransferaseHMT:HistonemethyltransferaseHDAC:HistonedeacetylaseHAT:HistoneacetyltransferaseMBD:Methyl-CpG-bindingprotein

Methylationinhistoneiii组蛋白的磷酸化

位点：主要发生在丝氨酸(S)/苏氨酸(T)功能：一般与基因活化相关A.转录调控：H3S10被Rsk(ribosomalS6Kinase)-2磷酸化B.异染色质的形成：H4S1的磷酸化C.DNArepair：H2AX(组蛋白2A变异体)磷酸化

Phosphorylationinhistoneiv组蛋白泛素化

Ubiquitinationinhistone

位点：主要发生在组蛋白C端赖氨酸(K)残基上生物学功能：

UbiquitinationofhistoneH2AandH2Bhasoppositeeffectstranscription.UbiquitinationofH2Bisassociatedwithgeneactivation;B.WhileH2Aubiquitinationcontributestogenesilencing.Wang,etal.,NATURE,VOL431,2004（4）Chromatinremodeling

指染色质位置和结构的变化。主要涉及密集的染色质丝在核小体连接处发生松解造成染色质解压缩，从而暴露基因转录启动子区中的顺式作用元件，为反式作用蛋白（转录因子）与之结合提供了一种称为可接近性（accesibility）的状态。这一过程由两类结构介导：ATP依赖型核小体重塑复合体和组蛋白修饰复合体。前者通过水解作用改变核小体构型；后者对核心组蛋白N端尾部的共价修饰进行催化,其中还有I型DNA酶（DNaseI）超敏性的改变。

通常，DNA甲基化、组蛋白甲基化和染色质的压缩状态和DNA的不可接近性，以及基因处于抑制和静息状态相关；而DNA的去甲基化、组蛋白的乙酰化和染色质压缩状态的开启，则与转录的启动、基因活化和行使功能有关。这意味着，不用改变基因本身的结构，而是改变基因转录的微环境条件就可以左右基因的活性：或者令其沉默（silencing），或者使其激活（activation）。其结果（表观遗传现象）包括基因沉默、基因组印记、DNA甲基化、X染色体失活（组蛋白H4不被乙酰化、CpG岛的高度甲基化）、转座因子激活和基因组印记等多个方面。

染色质重塑

Chromatinstructureplaysarole

ineukaryoticgeneregulation

(5)RNAi(RNAinterference)一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰.

RNA相关沉默RNA干扰（RNAi）作用是生物体内的一种通过双链RNA分子在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的过程。由于RNAi发生在转录后水平，所以又称为转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）。

iRNAi的研究历程

siRNA(smallinterferenceRNA)

结构：21-23nt的双链结构，序列与靶mRNA有同源性，双链两端各有2个突出非配对的3’碱基。功能：是RNAi作用的重要组分，是RNAi发生的中介分子。内源性siRNA使细胞能够抵御转座子、转基因和病毒的侵略。

miRNA(microRNA)结构：21-25nt长的单链小分子RNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。特点：具有高度的保守性、时序性和组织特异性。ii参与RNA干扰的主要分子

siRNA介导的RNAi

BlockingGeneExpression

-NobelPrize2006

诺贝尔奖评审委员会评语：他们的发现能够解释许多令人困惑、相互矛盾的实验观察结果，并揭示了控制遗传信息流动的自然机制。这开启了一个全新的研究领域，未来这种技术能用来直接从源头上让致病基因“沉默”，更有效的治疗癌症甚至艾滋病，在农业上也将大有可为。

GeneTransferforChaloneSynthetase

(CHS-蝴蝶兰查尔酮合酶gene）,RichJorgensen1990

CosuppressionAntisenseRNAandRNAi1995,Guo’sexperimentCaenorhabditiseleganspar-1genesenseRNA,blockinggeneexpression

1998,AndrewFireandCraigMello

Organism:Caenorhabditiselegans

RNA:dsRNAResult:degradationofmRNAProcess:RISC:RNA-inducedsilencingcomplex

RNAiiiiRNA沉默机制

MicroRNA(miRNA)genes

miRNAprocessingandRNAinterference

TransgenicmiceandRNAinterferenceChemicalmodificationsiRNAdelivery

TransgenicmiceandRNAinterferenceViralvectorsiRNAdelivery

1961年M.F.Lyon就提出了关于雌性哺乳动物体细胞的两条X染色体中会有一条发生随机失活的假说，并认为这是一种基因剂量补偿的机制。1996年G.D.Penny等发现X染色体的Xq13.3区段有一个X失活中心(X-inactioncenter，Xic)，X-失活从Xic区段开始启动，然后扩展到整条染色体。

(6)X染色体失活组蛋白H4不被乙酰化CpG岛的高度甲基化

失活X染色体特点：Xchromosomeinactivation有袋类胎盘类两条染色体都表达不稳定的Xist(X-inactivionspecifictranscript)RNA

X染色体失活过程（起始阶段）其中一条X染色体表达的XistRNA包裹自身并启动异染色质化过程

X染色体失活过程（进展阶段）活性X染色体停止表达不稳定的XistRNA，已有的XistRNA很快降解。

X染色体失活过程（终末阶段）近几年，哺乳动物克隆取得较大进展，体细胞克隆已在多种哺乳动物获得成功，但成功率仍很低，面临着许多问题：重构胚难以植入子宫、流产率高、胎盘过大、出生个体体重过重、许多个体有呼吸循环系统疾病等。这些异常表型的高发性和穿越种间的相似性说明：这些问题主要不是由遗传信息的改变引起的，而是由外遗传信息的改变导致的，其主要原因就是基因没有获得正确的重新编程。

（7）基因表达的重新编程甲基化状态在分化的体细胞上是稳定和可遗传的，但在哺乳动物中至少有两个时期，一个是配子发生期，另一个是胚胎期，基因组的甲基化状态发生广泛的重新编程。

i配子发生和胚胎发育中的甲基化现象在小鼠，全局性的去甲基化发生在原始生殖细胞(PGC,primordialgermcells)发育早期。一旦PGC去甲基化，雄性生殖细胞的有丝分裂和雌性生殖细胞的减数分裂都将停止。几天后，雄性生殖细胞开始再甲基化，再甲基化将有助于生殖细胞有丝分裂的重新开始及随后的减数分裂。雌性生殖细胞的再甲基化则发生在出生后卵的生长期，DNMT3a/3L是可能的参与者，但不确定。

a配子发生中的甲基化现象在胚胎期，同样发生全局性的去甲基化和再甲基化过程。当精子进入卵子，在精子DNA未复制之前，精子基因组就已发生广泛的去甲基化。因为细胞核中没有DNMTl，卵子的基因组则经过一个被动去甲基化过程，直至桑椹胚。当囊胚植入子宫后，立即发生由DNMT3a/3L介导的从头甲基化，但仅作用在内细胞团(innercellmass)，滋养外胚层不被从头合成甲基化，此时需别的外遗传标记使基因组序列被甲基化或不被甲基化。

b胚胎发育中的甲基化现象印记基因的“印记”形成于配子发育晚期，并且独立于胚胎发育中的全局性去甲基化作用和甲基化作用；在配子发生晚