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文档简介

植物病毒可用作蛋白质过表达和序列特异的基因沉默的表达载体,两者都是功能基因组学研究工具.病毒诱导的基因沉默(VIGS)的获得1.构建载体目的基因替换病毒中的与病毒复制、运动无关的基因直接插入到病毒基因组中2植物的转化农杆菌3病毒携带目的基因在植物中复制和传播

原理RNAi

病毒复制过程中形成的双链RNA触发植物中与之具有高度序列一致性的mRNA降解。

Dicer酶优点：1、试验周期短

2、可以研究T-DNA标记的敲除突变体和表达了沉默诱导基因的转化子中有致死表型的基因缺点：1、不易获得针对特异物种的病毒载体

2、感病表型可能与靶基因沉默表型混淆VIGS应用的病毒和载体烟草：烟草花叶病毒TMV大麦：大麦条纹花叶病毒barleystripemosaicvirus拟南芥：卷心菜曲叶病毒cabbageleafcurlvirus番茄：烟草脆裂病毒tobaccorattlevirus(TRV)马铃薯：PotatovirusX(PVX)实验目的构建适合不同植物（豆科）的VIGS载体选用的病毒：Peaearlybrowningvirus(PEBV)原因：1、与TRV同属

2、已建成带有GFP报告基因的表达载体结果1、PEBV侵染克隆的构建双元载体系统(binaryvectorsystem)农杆菌介导的植物转化机理本实验用的载体的构建植物转化：农杆菌注射法（agro-inoculation）植物转化：农杆菌注射法agro-inoculation转化pCAPE1、pCAPE2-GFP保存的农杆菌液分别用含有50ng/μL卡那霉素和100ng/μL利福平的LB液体培养基培养过夜。培养到OD=1.2-1.5时，取菌液加入到1.5mL离心管中，离心，用含10mMNaCl、0.1mM乙酰丁香酮、1.75mMCaCl2的培养基重悬，静置90min。两种转化质粒的农杆菌等量混合。注射植物。嫩叶用1mL注射器在远轴端挑叶背，但不挑破，吸取制备好的菌液注射。检测转化体系21天后，在注射叶子上面新长出来的叶子上检测到绿色荧光说明转化体系成功。结果2、八氢番茄红素去饱和酶基因（PDS）的沉默PDS是产生类胡萝卜素的关键基因，沉默后产生光漂白现象PsPDS:P.sativum中的PDS基因现象RT-PCR检测PDSmRNA水平的变化讨论最广泛应用的病毒是PVXTRVVIGS应用还主要用于烟草。说明烟草感染效率高，发展针对其它寄主的PEBV载体的难度。农杆菌注射法的感染效率可达100%其高效性、可靠性为应用作高通量研究打下基础。N.benthamiana中PVX

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