食品检验工培训课件蛋白质

蛋白质和氨基酸的测定本文档共52页；当前第1页；编辑于星期一\5点22分1概述2凯氏定氮法3蛋白质的快速测定法4氨基酸总量的测定5氨基酸的分离与测定主要内容本文档共52页；当前第2页；编辑于星期一\5点22分1概述（1）蛋白质的生理功用及在食品中的作用（2）食品中的蛋白质含量（3）蛋白质系数（4）蛋白质水解（5）蛋白质测定方法本文档共52页；当前第3页；编辑于星期一\5点22分①蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。②人体的酸碱平衡、水平衡的维持；③遗传信息的传递；④物质的代谢及运转都与蛋白质有关。⑤人及动物只能从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质⑥食品的重要营养指标。（1）蛋白质的生理功用及在食品中的作用本文档共52页；当前第4页；编辑于星期一\5点22分(2)食品中的蛋白质含量

在各种不同的食品中蛋白质的含量各不相同，一般说来动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品，例如牛肉中蛋白质含量为20.0%左右，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为3.5%黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%，大豆为40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5%左右。

测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极重要的意义。本文档共52页；当前第5页；编辑于星期一\5点22分（3）蛋白质系数

蛋白质是复杂的含氮有机化合物，分子量很大，大部分高达数万~数百万，分子的长轴则长数nm~100nm,它们由20种氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，并具有一定的空间结构，所含的主要化学元素为C、H、O、N,在某些蛋白质中还含有微量的P、Cu、Fe、I等元素，但含氮则是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。本文档共52页；当前第6页；编辑于星期一\5点22分

不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。

不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。

本文档共52页；当前第7页；编辑于星期一\5点22分（4）蛋白质水解在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体内不能合成，必须依靠食品提供，故被称为必需氨基酸，他们对人体有极其重要的生理作用。

蛋白质胨肽氨基酸本文档共52页；当前第8页；编辑于星期一\5点22分（5）蛋白质测定方法

测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。

本文档共52页；当前第9页；编辑于星期一\5点22分

蛋白质的测定，目前多采用将蛋白质消化，测定其含氮量，再换算为蛋白质含量的凯氏定氮法。不同食品的蛋白质系数有所不同。

凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。2凯氏定氮法本文档共52页；当前第10页；编辑于星期一\5点22分

凯氏定氮法：常量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法。微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少，且有一套微量凯氏定氮器。目前通用以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法。在凯氏法改良中主要的问题是，氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题，即分解试样所用的催化剂。常量改良凯氏定氮法在催化剂中增加了二氧化钛。本文档共52页；当前第11页；编辑于星期一\5点22分(1)

原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。2.1常量凯氏定氮法本文档共52页；当前第12页；编辑于星期一\5点22分①样品消化2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4＝(NH4)2SO4＋6CO2＋12SO2＋16H2O

浓硫酸具有脱水性，有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫2H2SO4＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3＝(NH4)2SO4本文档共52页；当前第13页；编辑于星期一\5点22分②蒸馏：在消化完全的样品溶液中加入浓氢氧化钠使呈碱性，加热蒸馏，即可释放出氨气，反应方程式如下：

③吸收与滴定：加热蒸馏所放出的氨，可用硼酸溶液进行吸收，待吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影响指示剂的变色反应，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反应方程式如下：2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↓＋Na2SO4＋2H2O2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3本文档共52页；当前第14页；编辑于星期一\5点22分(2)适用范围

此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定(3)仪器①500ml凯氏烧瓶；②定氮蒸馏装置(4)试剂①硫酸铜

；

②硫酸钾；③

硫酸；④

40g∕L硼酸溶液；⑤混合指示剂；⑥400g∕L氢氧化钠；⑦0.1mol∕L盐酸标准溶液本文档共52页；当前第15页；编辑于星期一\5点22分(5)操作步骤①

样品消化：准确称取均匀的固体样品0.5～3g,或半固体样品2～5g,或吸取溶液样品15～25ml。小心移入干燥的凯氏烧瓶中(勿粘附在瓶壁上)。加入0.5～1g硫酸铜、10g硫酸钾及25ml浓硫酸，小心摇匀后，于瓶口置一小漏斗，瓶颈45°角倾斜置电炉上，在通风橱内加热消化（若无通风橱可于瓶口倒插入一口径适宜的干燥管，用胶管与水力真空管相连接，利用水力抽除消化过程所产生的烟气）。先以小火缓慢加热，待内容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力消化至溶液呈蓝绿色。取下漏斗，继续加热0.5h，冷却至室温。本文档共52页；当前第16页；编辑于星期一\5点22分本文档共52页；当前第17页；编辑于星期一\5点22分本文档共52页；当前第18页；编辑于星期一\5点22分②蒸馏、吸收本文档共52页；当前第19页；编辑于星期一\5点22分

按图装好蒸馏装置，冷凝管下端浸入接受瓶液面之下（瓶内预先装有50ml40g∕L硼酸溶液及混合指示剂5~6滴）。凯氏烧瓶内，加入100ml蒸馏水、玻璃珠数粒，从安全漏斗中慢慢加入70ml400g/L氢氧化钠，溶液应呈蓝褐色。不要摇动，将定氮球连接好。用直火加热蒸馏30min，将蒸馏装置出口离开液面继续蒸馏1min，用蒸馏水淋洗尖端后停止蒸馏。本文档共52页；当前第20页；编辑于星期一\5点22分③滴定：将接受瓶内的硼酸液用0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至终点。同时做一试剂空白（除不加样品，从消化开始操作完全相同）。本文档共52页；当前第21页；编辑于星期一\5点22分式中W—蛋白质的质量分数，%；

c—盐酸标准液的浓度，mol/L；V1—空白滴定消耗标准液量，mL；V2—试剂滴定消耗标准液量，mL；m—样品质量，g；0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；F—蛋白质系数。(6)结果计算本文档共52页；当前第22页；编辑于星期一\5点22分2.2微量凯氏定氮法(1)原理

微量凯氏定氮法的原理与操作方法，与常量法基本相同，所不同的是样品质量及试剂用量较少，且有一套适于微量测定的定型仪器——微量凯氏定氮器。本文档共52页；当前第23页；编辑于星期一\5点22分本文档共52页；当前第24页；编辑于星期一\5点22分①100ml凯氏烧瓶。②微量凯氏定氮器。

(2)仪器本文档共52页；当前第25页；编辑于星期一\5点22分①20g/L硼酸溶液。

②400g/L氢氧化钠。③1g/L甲基红乙醇溶液与1g/L溴甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5混合。④0.01000mol/L盐酸标准溶液⑤其他试剂同常量法。(3)试剂本文档共52页；当前第26页；编辑于星期一\5点22分

①样品消化：样品消化步骤同常量法。将消化完全的消化液冷却后，完全转入100容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。

(4)测定方法本文档共52页；当前第27页；编辑于星期一\5点22分②蒸馏

按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。在接受瓶内加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。本文档共52页；当前第28页；编辑于星期一\5点22分

吸取10.00ml样品消化稀释液，由进样漏斗进入反应室，以少量水冲洗进样漏斗，并流入反应室。再从进样口加入400g/L氢氧化钠10ml使溶液呈强碱性，用少量蒸馏水洗漏斗数次，盖塞，进行水蒸气蒸馏。冷凝管下端预先插入盛有10mL4%（或2%）硼酸吸收液,蒸馏至吸收液中所加的混合指示剂变为绿色开始记时，继续蒸馏10min后，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端后停止蒸馏。

本文档共52页；当前第29页；编辑于星期一\5点22分③滴定

取下接受瓶，以0.01000mol/L盐酸标准溶液滴定至微红色为终点。本文档共52页；当前第30页；编辑于星期一\5点22分(5)结果计算

式中W—蛋白质的质量分数，%；

V0—滴定空白蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL；V1—滴定样品蒸馏液消耗盐酸标准液体积，mL；V2—蒸馏时吸取样品稀释液体积，mL；C—盐酸标准液的浓度，mol/L；0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol；F—蛋白质系数；

m—样品质量，g。本文档共52页；当前第31页；编辑于星期一\5点22分2.3样品的分解条件（1）K2SO4或Na2SO4：提高溶液的沸点（2）催化剂CuSO4

氧化汞和汞良好的催化剂，但剧毒；硒粉（3）氧化剂过氧化氢本文档共52页；当前第32页；编辑于星期一\5点22分硫酸钾

加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，它与硫酸钾作用生成硫酸氢钾可提高反应温度一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高到4000C以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大，故沸点升高，其反应式如下：

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3但硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失：

（NH4）2SO4=NH3↑+(NH4)HSO42(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O除硫酸钾外也可加入硫酸钠，氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。本文档共52页；当前第33页；编辑于星期一\5点22分硫酸铜

CuSO4

①催化剂2CuSO4=CuSO4+SO2↑+O2C+2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

此反应不断进行，待有机物被消化完后，不再有硫酸亚铜（褐色）生成，溶液呈现清澈的蓝绿色。②可以指示消化终点的到达③下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

作用本文档共52页；当前第34页；编辑于星期一\5点22分（1）所用试剂应用无氨蒸馏水配制。（2）消化过程应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝酸液将附在瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。（3）若样品含脂肪或糖较多时，应注意发生的大量泡沫少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂，防止其溢出瓶外，并注意适当控制热源强度。（4）若样品消化液不易澄清透明，可将凯氏烧瓶冷却，加入300g/L2~3ml过氧化氢后再加热。2.4注意事项本文档共52页；当前第35页；编辑于星期一\5点22分（5）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。（6）消化时间一般约4小时左右即可，消化时间过长会引起氨的损失。一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸或组氨酸时，消化时间需适当延长，因为这两种氨基酸中的氮在短时间内不易消化完全，往往导致总氮量偏低。有机物如分解完全，分解液呈蓝色或浅绿色。但含铁量多时，呈较深绿色。本文档共52页；当前第36页；编辑于星期一\5点22分（7）蒸馏过程应注意接头处无松漏现象，蒸馏完毕，先将蒸馏出口离开液面，继续蒸馏1min，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。（8）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，否则氨吸收减弱，造成损失，可置于冷水浴中。（9）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。本文档共52页；当前第37页；编辑于星期一\5点22分

半微量凯氏定氮本文档共52页；当前第38页；编辑于星期一\5点22分4氨基酸态氮的测定本文档共52页；当前第39页；编辑于星期一\5点22分

蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，虽然从各种天然源中分离得到的氨基酸已达175种以上，但是构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种，而在构成的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨算、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必需氨基酸，它们对人体有着极其重要的生理功能，常会因其在体内缺乏而导致患病或通过补充而增强了新陈代谢作用。

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随着食品科学的发展和营养知识的普及，食物蛋白质中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的构成，愈来愈得到人们的重视。为提高蛋白质的生理效价而进行食品氨基酸互补和强化的理论，对食品加工工艺的改革，对保健食品的开发及合理配膳等工作都具有积极的指导作用。因此，食品及其原料中氨基酸的分离、鉴定和定量也就具有极其重要的意义。本文档共52页；当前第41页；编辑于星期一\5点22分氨基酸态氮的测定双指示剂甲醛滴定法：原理、试剂、测定方法、结果计算、说明电位滴定法：原理、试剂、仪器、测定方法、结果计算本文档共52页；当前第42页；编辑于星期一\5点22分4.1双指示剂甲醛滴定法(1)原理氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的-NH2基。它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。反应式（有三种不同的推论）如下：RCHH3NCCORCCOHOHNH2+HCHORCCOOHHNCH2+NaOHRCHCOOHNHCH2OH或RCHCOOHN(CH2OH)2或RCHCOONaNCH2或RCHNHCOOHCHO本文档共52页；当前第43页；编辑于星期一\5点22分(2)方法特点及应用

此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基酸含量的变化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。普氨酸与甲作用时产生不稳定的化合物，使结果偏高;溶液中若有存在也可与甲醛反应，往往使结果高。本文档共52页；当前第44页；编辑于星期一\5点22分(3)试剂①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至淡蓝色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液③0.1%中性红50%乙醇溶液④0.1%mol/L氢氧化钠标准溶液本文档共52页；当前第45页；编辑于星期一\5点22分(4)操作方法移取含氨基酸约20～30mg的样品溶液2份，分别置于250ml锥形瓶中，各加50ml蒸馏水，其中1份加入3滴中性红置试剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点；另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml，摇匀，静置1分钟，用0.1ml/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别纪录两次所消耗的碱液ml数。本文档共52页；当前第46页；编辑于星期一\5点22分式中c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L;